4.4. Ксенобиотики как загрязняющие факторы окружающей среды

Экотоксикантом называется токсичное и устойчивое в условиях окружающей среды вещество, способное накапливаться в организмах до опасных уровней концентраций. Чужеродные для организмов химические вещества, не входящие в естественный биотический круговорот и, как правило, прямо или косвенно порожденные человеческой деятельностью, называют ксенобиотиками.

Таблица

Источники загрязнения

Источники		Примеры
1. Естественные	- космохимические	Вулканические выбросы, фотохимические процессы, лесные пожары, пылевые бури, загрязнения канцерогенными веществами, токсинами (ПАУ, ХАУ, диоксины)
	- вулканические
	- геохимические
	- биотические
2. Антропогенные	- механические	Сброс твердых инертных веществ, шумовое загрязнение, вибрация, электромагнитное загрязнение
	- радиоактивные
	- биологические
	- загрязнения, связанные с физическими факторами
	- химические и радиоактивные загрязнения

Перенос и трансформация ксенобиотиков в окружающей среде можно изобразить схемой:

Биохимический распад основных видов ксенобиотиков

Пестициды: 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) разрушается бактериями рр. Flavobacterium и Achromobacter, с образованием 2,4-дихлорфенола и 3,5-дихлорпирокатехина. Разложение штаммом Nocardioides simplex 3E начинается с элиминирования ацетатной группы с последующим гидроксилированием хлорированного ароматического кольца:

В процессах трансформации и детоксикации ПАВ в почве ведущая роль принадлежит бактериям родов Pseudomonas и Bacillus. Происходит окисление терминальной метильной группы алкильной цепи до карбоксильного остатка с последующим ее β-окислением и гидролизом полиэтиленгликолиевой цепи:

ПАУ: окисляются отдельными видами бактерий родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia и грибов Aspergillus, Penicillium. Подвергаются гидроксилированию с последующим расщеплением дигидроксилированного кольца:

Разложение органических галогенированных соединений катализируется монооксигеназами, диоксигеназами:

2. Микроорганизмы — деструкторы ксенобиотиков. Селекция промышленных штаммов-деструкторов загрязняющих веществ, ее основные направления. Генетические основы создания рекомбинантных микроорганизмов — деструкторов органических ксенобиотиков.

Микроорганизмы-деструкторы ксенобиотиков

Ведущая роль в трансформации и минерализации, органических ксенобио­тиков принадлежит хемоорганотрофным (гетеротрофным) микроорганиз­мам, особенно бактериям, синтезирующим разнообразные ферментные системы. Из бактерий, расщепляющих органические ксенобиотики, по частоте встречаемости, числу видов (около 30) и спектру разрушаемых соединений первое место занимают псевдомонады.

Смешанные популяции, как правило, быстрее и полнее разрушают мно­гие синтетические соединения. Это характерно для ситуации, когда отдель­ный вид организмов трансформирует одно соединение в другое, но не имеет ферментативной системы для его дальнейшей деградации. Этой спо­собностью обладает другой организм, в результате соединение разлагается полностью.

Биодеградирующая активность сообщества микроорганизмов зависит от его состава, скорости роста и обмена между видами питательными веще­ствами и генетическим материалом. Накапливаемые метаболиты могут быть токсичны для одного компонента сообщества и могут усваиваться другими микроорганизмами, что ускоряет в совокупности процесс разло­жения (феномен детоксификации).

Селекция промышленных штаммов-деструкторов загрязняющих веществ

Основные принципы селекции микроорганизмов-деструкторов:

• выделять монокультуры или сообщества микроорганизмов (изоляты) из сред, загрязненных теми или иными ксенобиотиками;

• использовать биологический агент, изолированный из той же загряз­ненной природной или техногенной среды, для очистки которой он предназначен;

• выделять микроорганизмы из мест с застарелыми загрязнениями или с неоднократным поступлением ксенобиотиков. В этом случае велика вероятность, что число организмов, деградирующих ксенобиотик, уве­личилось под действием естественного отбора. Для выделения таких изолятов эффективен метод накопительных культур;

• накапливать биологический материал для деградации вещества-загрязнителя лучше всего на этом же субстрате либо на его легко ути­лизируемых аналогах;

• использовать уже известные штаммы-деструкторы (музейные культуры) или на базе существующих конструировать рекомбинантные штаммы.

Генетические основы создания рекомбинантных микроорганизмов-деструкторов органических ксенобиотиков

Помимо селекционных методов, перспективно получение рекомбинантных микроорганизмов методами генной инженерии.

Способность микроорганизмов разрушать ксенобиотики зависит от наличия в клетках генов, определяющих синтез ферментов, участвующих в деградации соединения. Конструирование рекомбинантных штаммов - деструкторов ксенобиотиков заключается в объединении нескольких генов или их блоков, ответственных за первичный метаболизм соединений. Преимущество такого объединения - генетически модифицированные микроорганизмы (ГММО) могут синтезировать раз­личные ферментые системы, что позволяет эффективно и быстро разру­шать широкий спектр химических загрязнений. Генетическая модификация позволяет повысить устойчивость микроорганизмов к неблагоприятным факторам среды, придать им новые важные для практического применения свойства.

В генной инженерии бактериальные плазмиды используют в качестве векторных систем для передачи генетического материала от хозяина (клетки донора) в клетки реципиента. Они представляют собой саморегу­лирующиеся кольцевые двунитевые молекулы ДНК и способны стабильно и автономно существовать в клетке в характерном для каждого типа плазмид числе копий. Саморепликация плазмиды осуществляется с по­мощью ферментных систем клетки-хозяина. Плазмиды относятся к под­вижным элементам (векторам), т.е. способны к внутривидовому переносу между клетками популяции, клетками различных видов и родов микроор­ганизмов.

Таким образом, генетическая конструкция и механизмы переноса ге­нов обеспечивают необходимую пластичность бактериального генома и метаболизма ксенобиотиков микроорганизмами, их адаптацию к различ­ным соединениям и быстрое распространение необходимых генов внутри популяции.на рисунке 3 представлена схема создания бактериального штамма.

Рис. 3. Создание бактериального штамма, способного разрушать ксенобиотики. Штамм А, несущий плазмцду САМ (она детерминирует разрушение камфары), скрещивают со штаммом В, несущим плазмиду ОСТ (разрушение октана). При этом образуется штамм Е, который содержит гибридную плазмиду, образовавшуюся в результате гомологичной рекомбинации между исходными плазмидами и обладающую функциями каждой из них. Штамм С, содержащий плазмиду ХУL (разрушение ксилола), скрешивают со штаммом D, содержащим плазмиду NАН (разрушение нафталина), и получают штамм Е, который несет обе эти плазмиды. Наконец, скрещивают штаммы Е и Р, в результате чего образуется штамм G, содержащий плазмиды САМ/ОСТ, ХУL и NАН.

Плазмиды биодеградации (D-плазмиды) наиболее распространены у грамотрицательных бактерий. Наиболее часто они идентифицируются у бактерий р. Pseudomonas.

Плазмиды как объекты генной инженерии позволяют in vitro сконст­руировать de novo геном клетки, используя эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), передать его в клетки реципиентов конъюгацией, трансфор­мацией или трансдукцией и при включении в клетку большого числа плазмидных копий увеличить число необходимых генов. Конструирование и пе­редача генома облегчаются спецификой генетической организации систем биодеградации. Во-первых, они локализуются в трансмиссивных плазмидах, что обеспечивает горизонтальный внутривидовой и межвидовой перенос между бактериями. Во-вторых, многим системам биодеградации присуща организация, обеспечивающая рекомбинационное включение генов в новые плазмидные репликоны, а также интегрирование переносимых генов в хро­мосому и получение различных комбинаций генов.

Банки векторов и носителей позволяют конструировать штаммы, спо­собные к биодеструкции ксенобиотиков при различных условиях среды и содержащие не только гены деструкции, но и, например, гены синтеза био-ПАВ, или фермента люциферазы, что улучшает биодоступность ксено­биотиков и облегчает наблюдение за рекомбинантными штаммами в окру­жающей среде.

Основные источники поступления ксенобиотиков в природные среды, пути их миграции и превращения

Человеку удалось создать такие соединения, которые не разрушаются в природе в обычных условиях. Это различные синтетические полимеры, красители, пестициды, фармацевтические препараты, моющие средства и т.д. Эти чужеродные вещества (ксенобиотики) имеют уникальную биологическую активность уже на уровне микропримесей. В широком смысле к ксенобиотикам могут быть отнесены и вещества природного происхождения, но полученные в сверхколичествах и перемещенные в несвойственные им места (например, нефть).

Большинство таких соединений обладает значительной стабильностью, и для их полного разложения при обычных условиях требуются столетия. Происходит непрерывный перенос этих веществ по пищевым цепям и их накопление на конечных этапах, к которым относится и человек.

Огромное число ксенобиотиков чрезвычайно токсично и проявляет мутагенную, канцерогенную, аллергенную и тератогенную активности. Однако понятно, что человечество не может полностью отказаться от использования таких веществ, так как они применяются практически во всех областях деятельности. Поэтому на первый план выходит использование биоразрушающей способности микроорганизмов для очистки окружающей среды от антропогенных загрязнителей.