Молекулярная биофизика

1. Задачи и методы молекулярной биофизики

2. Свободные радикалы в биологических системах

3. Конформации макромолекул и типы взаимодействий в них

4. Биологические функции белков. Структура белков.

5. Структура и конформации нуклеиновых кислот

1. Задачи и методы молекулярной биофизики

Основная задача молекулярной биофизики - выяснить связь физической структуры и свойств биологически важных молекул с выполняемыми ими в организме функциями.

В настоящее время в молекулярной биофизике используют следующие методы исследования:

1. Электронная микроскопия. В электронном микроскопе вместо световых лучей используется сфокусированный пучок электронов, летящих в вакууме (как в кинескопе телевизора), разгоняемых очень высоким напряжением. Поскольку длина волны электронов (а они обладают свойствами и волн, и частиц) в сотни тысяч раз меньше, чем световая длина волны, то и разрешающая способность достигает 5 ангстремов (1 ангстрем=10^-10 м).

2. Одним из информативных методов молекулярной биофизики является ренгеноструктурный анализ, который позволяет получить прямую информацию о пространственной структуре макромолекул (в трехмерном пространстве). Метод основан на явлении дифракции (дифракция рентгеновских лучей). Она наблюдается в тех случаях, когда на пути лучей встречаются препятствия, срав­нимые по размеру с длиной волны луча.

Когда на исследуемый объект направляют параллельный пучок рентгеновских лучей, а за объектом помещают фотопленку, на ней регистрируется дифракционная картина. На рентгенограмме видно множество пятен (дифракционных максимумов), образую­щихся в результате интерференции дифрагированных лучей. Ана­лиз рентгенограммы позволяет получить сведения о структуре объ­екта на молекулярном (и даже атомном) уровне. Ценность данного метода состоит в том, что он, дает возможность во-пер­вых, изучить пространственное расположение молекул, точно из­мерить расстояние между ними, выявить их внутримолекулярную организацию, во-вторых — определить структуру нефиксирован­ных препаратов.

3. Группа спектральных методов применяются для решения самых разнообразных задач при исследовании строения и свойств органических соединений и их количественном анализе, определения структуры и идентификация, изучение кинетики и механизма биохимических реакций. Главное преимущество спектральных методов состоит в том, что вещество в процессе исследования не разрушается, высокая чувствительность, воспроизводимость, простота получения анализов. В основе этих методов лежит поглощение света веществом, при этом вещество может переходить в более высокое энергетическое состояние – возбужденное. Длины волн, при которых происходит поглощение, и степень поглощения зависят от структуры и от окружения молекулы, поэтому спектроскопия является полезным инструментом для характеристики макромолекул различного размера.

а. ИК-спектроскопия. Поглощение света в инфракрасной области (10³-10⁵ нм). Идентификация числа водородных связей и функциональных групп. Участвующих в образовании водородных связей, и изучение разрыва водородных связей при денатурации белка.

б. Флуоресценция исключительно чувствительный метод определения минимальных количеств вещества, поскольку для любого флуоресцирующего вещества интенсивность флуоресценции пропорциональна интенсивности падающего света. (Некоторые молекулы при поглощении фотона испускают свет с большей длиной волны.) Путем измерения флуоресценции можно получить сведения о конформации, местах связывания с растворителем и межмолекулярных расстояниях макромолекул.

3. ЭПР (электронной парамагнитный резонанс) открыт в 1944 году Завойским. ЭПР – резонансное поглощение энергии электромагнитных колебаний в сантимеметровом или миллиметровом диапазоне длин волн веществами, содержащими парамагнитные частицы (молекулы, атомы, ионы, свободные радикалы, слабо связанные с атомом электроны). Ценность этого метода заключается в том, что он позволяет обнаруживать неспаренные электроны даже при очень низкой их концентрации в любом веществе. Неспаренные электроны играют чрезвычайно важную роль в любой химической или биологической системе благодаря их высокой реакционной активности. Изучение свойств и поведения неспаренных электронов в биологических системах дает возможность судить о молекулярных механизмах работы отдельных биофизических и биохимических реакций. Вещества, содержащие неспаренные электроны можно разделить на две группы:

1. Неспаренные электроны связаны либо со всей молекулой, либо с большей ее частью. Эти электроны делокализованы по всей молекуле. Такое состояние молекулярных орбиталей встречается в живых организмах очень широко, в частности коферменты (флавины, убихинон, НАД). Регистрация концентрации веществ даст прямую информацию о скорости протекания электрон-транспортных процессов в митохондриях, т.е. судить о биоэнергетике.

2. Ко второй группе веществ, содержащих неспаренные электроны, относятся такие соединения, в которых неспаренный электрон связан только с одним каким-либо атомом и не перемещается по делокализованным молекулярным орбитам. Такие неспаренные электроны обычно связаны с атомами переходной группы – железом и никелем. Число этих электронов зависит от проявляемой ими валентности.

Обнаружение и характеристика неспаренных электронов методом ЭПР связано с тем, что электрон обладает магнитным моментом, связанным со спином (собственный момент количества движения неспаренного электрона – по-другому говоря угловой момент). Вы знаете, что электроны вращаются по своим орбитам и направление их движения друг с другом не совпадает. Для того чтобы охарактеризовать эти неспаренные электроны, необходима общая координатная ось.

Однако в отсутствие внешнего магнитного или электрического поля такой оси нет. Но если к образцу приложить внешнее магнитное поле, то неспаренные электроны разделятся на две группы: в одной из них спины (вращение) будут ориентированы параллельно направлению поля, а в другой – антипараллельно. Электроны этих двух групп будут обладать и разной энергией. Это происходит потому, что при ориентации магнитного момента параллельно магнитному полю, энергия электрона уменьшается, а при ориентации его в обратном направлении возрастает.

Итак, если к веществу, содержащему неспаренные электроны, приложить внешнее магнитное поле, то электронные разбиваются на две группы, обладающими разными энергиями, т.е. происходит расщепление энергетических уровней. На этом и основан метод ЭПР.

Обычно изучаемый образец помещают в сильное однородное магнитное поле и одновременно подают электромагнитное излучение такой частоты, чтобы hν, т.е. квант энергии излучения был равен разности между энергетическими уровнями обеих групп (т.н. резонансная частота)

условие резонанса, где h – постоянная Планка, ν – частота переменного электромагнитного поля, g – фактор расщепления: отношение магнитного момента частицы к ее механическому моменту (спину), β – магнетон Бора, Н – напряженность магнитного поля. За счет энергии излучения неспаренные электроны, находящиеся на более низком энергетическом уровне, переходят на верхний уровень. Это поглощение энергии электронами при их переходе на верхний уровень может быть обнаружено по уменьшению мощности электромагнитного излучения, проходящего через образец и зарегистрировано на самописце и на экране осциллографа. По этим спектрам, как правило, рассчитывается концентрация свободных радикалов по пикам или же по площадям. Чувствительность метода ЭПР велика: в водных растворах удается обнаружить 10^-8 моль/л свободных радикалов.

Метод спиновых меток (разновидность) заключается в том, что вещество с известными парамагнитными свойствами присоединяют к большой биологической молекуле, а затем исследуют влияние нового окружения на спектр ЭПР этой метки. Таким способом можно изучать ориентацию и природу химических связей вокруг свободного радикала, служащего спин-меткой и с большей точностью обнаружить наличие молекулярного движения.

4. ЯМР ( ядерный магнитный резонанс) – спектроскопический метод, способный давать информацию о структуре биополимеров и молекулярном движении.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) - резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, обусловленное переориента­цией системы магнитных моментов атомных ядер в постоянном магнитном поле. ЯМР, как и ЭПР, - один из методов радиоспектро­скопии, был открыт и объяснен Ф.Блохом и Э.Перселлом в 1946 г. Этот процесс избирательного поглощения электромагнитной энер­гии наблюдается в сильном постоянном магнитном поле, на которое накладывается слабое радиочастотное магнитное поле (с частотой порядка 40 МГц), перпендикулярное постоянному. Частота радио­волн в методе ЯМР зависит как от типа изотопа, так и от напряжен­ности магнитного поля.

Условие резонанса записывают аналогично электронно-парамаг­нитному резонансу.

Атом помещенный в постоянное магнитное поле и при положении под прямым углом к нему переменного поля, при некоторой частоте последнего начнет поглощать энергию. Энергия, поглощаемая одним ядром мала, но если заставить большое число ядер поглощать энергию одновременно, то резонанс можно измерить.

Для расшифровки сложных спектров регистрируют 10-1000 спек­тров одного и того же образца и вводят экспериментальные данные в компьютер для получения среднего спектра или спектра, получаемого путем накопления. ЭВМ-приставки используют при исследовании слабопоглощающих биологических образцов.

ЯМР высокого разрешения представляет собой стандартный ме­тод определения строения органических молекул, используемый также для исследования механизма и кинетики химических и био­химических реакций.

Спектроскопия ЯМР находит все более широкое применение в биологии (биофизике) и в медицине. Так, методы ЯМР были эф­фективно использованы при анализе конформационных свойств биополимеров, взаимодействий белков с фармакологическими ве­ществами, взаимодействий фермент - лиганд (гемопротеиды), био­полимеры - вода, антиген - антитело. Очень часто методы ЯМР ис­пользуют для определения природы химических групп, участвую­щих в образовании специфических комплексов (сывороточный аль­бумин - пенициллин, сывороточный альбумин - стрептомицин, ал-. когольдегидрогеназа - НАД), а также природы вновь образующихся связей (например, водородной), ЯМР на ³¹Р и ¹³С успешно приме­няется и для изучения живых клеток и тканей (изменение концент­рации АТФ).