- •Министерство образования и науки российской федерации
- •Список сокращений
- •Глава 1. Обзор литературы
- •Нейродегенерация и актиновый цитоскелет
- •1.2. Limk1 как ключевой фермент ремоделирования актина
- •1.3. Нейродегенерация и белки теплового шока
- •1.4. Бтш70: структура и основные функции
- •1.5. Нейродегенерация и нейротрофические факторы – подходы к терапии
- •1.6. Gdnf и его функциональная роль
- •1.7. Взаимосвязь сетей трансдукции limk1, gdnf и бтш
- •Глава 2. Материал и методы исследования
- •2.1. Материал исследования
- •2.2. Воздействие тепловым шоком
- •2.3. Иммунофлюоресцентный анализ распределения бтш70
- •2.4. Иммунофлюоресцентный анализ распределения gdnf
- •3.1.2. Распределение бтш70 у линий дрозофилы с полиморфизмом по гену limk1 после теплового шока
- •3.1.3. Распределение gdnf у линий дрозофилы с полиморфизмом по гену limk1 в норме
- •3.1.4. Распределение gdnf у линий дрозофилы с полиморфизмом по гену limk1 после теплового шока
- •3.2. Обсуждение.
- •Заключение
3.2. Обсуждение.
Дрозофилы одни из ведущих генетических моделей для исследования эмбрионального развития и функциональной неврологии. Однако взаимодействие между этими исследованиями лежит в основе приобретения функциональной электрической сигнализации и разграничения функциональных химических синапсов в ходе заключительной фазы формирования нейронной цепи. У дрозофилы, эти этапы функционального развития возникают в период более 8 часов (при температуре 25 C) в течение последней трети эмбриогенеза. Поэтому стрессоустойчивость нервной системы дрозофилы является критической для выживания организма. При действии ТШ хорошо прослеживается образование связи между мотонейроном и специфическим ему мышечным волокном. Таким образом при развитии в условиях повышенной температуры у личинки Drosophila детектируется усиление ветвления аксонов и усиление проведения сигнала во внутриклеточных сигнальных каскадах.
Компоненты сигнального каскада связаны с БТШ при организации ответа клетки на тепловой шок, т.к. функционирование системы БТШ тесно связано с функционированием актинового цитоскелета.
БТШ индуцируются при действии различных факторов, вызывающих в клетке состояние физиологического стресса, обеспечивают способность клетки и организма переносить экстремальные воздействия, играют важную роль в защите клетки от повреждений, в быстром и полном восстановлении исходного метаболизма после окончания стрессорных воздействий.
Белки семейства БТШ70 относятся к молекулярным шаперонам, которые представляют собой обширную группу клеточных белков, участвующих в защите клетки от стресса. Они участвует в сборке вновь синтезированных белков; переносят белки через мембраны органелл; участвуют в разборке олигомерных белковых структур и протеолитической деградации нестабильных белков; контролируют биологическую активность регуляторных белков, включая транскрипционные факторы.
Таким образом, БТШ являются одним из основных факторов внутриклеточной адаптации и устойчивости к неблагоприятным воздействиям, включая гипертермию. Поэтому, количество и локализация БТШ, индуцируемых клеткой в ответ на действие ТШ, является важным критерием адаптивности клетки и целого организма к факторам окружающей среды.
Полученные нами результаты свидетельствуют о сохранении локализации БТШ70 при действии ТШ у обеих исследуемых линий с ядрами глиальных клеток, это позволяет предположить, что большая часть этого белка находится в глиальных клетках, что полностью согласуется с литературными данными.
Но, поскольку интенсивность окраски антителами к БТШ70 до и после действия ТШ у исследуемых линий имеет характерные различия, то и количество БТШ70 значительно отличается. После действия ТШ у линии дикого типа Canton-S интенсивность окрашивания возрастает, т.е. увеличивается количество БТШ70 в ответ на стресс. У других линий дикого типа Berlin и Oregon-R количество БТШ70 также возрастает и на фоне общего увеличение синтеза БТШ70 происходит его перераспределение по структурам. Однако у мутантной линии agnts3 после ТШ интенсивность окрашивания значительно уменьшается, а, следовательно, количество БТШ70.
Выявленные межлинейные различия содержания БТШ70, а в частности уменьшение количества БТШ70 в ответ на стресс у мутантной линии agnts3 могут быть вызваны вследствие дефекта по синтезу LIMK1, ключевого фермента ремоделирования актина. Сигнальный каскад ремоделирования актина, передает сигнал по цепочке: рецепторы нейротрансмиттеров – малые ГТФазы Rho-семейства – LIM-киназа 1 (LIMK1) –кофилин – актин. После активации LIMK1 фосфорилирует кофилин и смещает соотношение G-актин/F-актин в сторону образования F-актина. В данном случае вследствие дефекта синтеза LIMK1 происходит образование кофилин-актиновых комплексов, которые накапливаются в аксонах и дендритах нейронов, тем самым блокируют везикулярный транспорт, что является причиной атрофии нейритов.
Поскольку у линий дикого типа Canton-S, Berlin и Oregon-R данного дефекта нет, и сигнальный каскад ремоделирования актина состоит из всех необходимых компонентов, то количество БТШ70 увеличивается в ответ на стресс, что свидетельствует о правильной организации ответа клетки на ТШ.
Таким образом, вследствие выявленных межлинейных различий содержания БТШ70 показано снижение количества БТШ70 у мутантной линии agnts3 при действии стресса, что свидетельствует о неспособности данной линии к адаптации.
Используя в качестве модели личинки Drosophila можно проследить взаимодействия сигнальных сетей GDNF и ремоделирования актинового цитоскелета, который определяет локализацию рецепторов нейромедиаторов в синаптических уплотнениях и морфологию шипиков дендритов, влияет на синаптическую пластичность – основу процессов обучения и памяти. Выраженное влияние на поддержание целостности синапсов и дендритов имеет еще LIMK1. LIMK1 взаимодействует с нейрегулинами – факторами стимуляции синтеза GDNF.
GDNF принадлежит к семейству TGF-β, секретируют его клетки глии. GDNF имеет выраженное нейропротекторное действие на дофаминэргические нейроны и мотонейроны спинного мозга, также стимулирует рост аксонов.
Существует корреляция между увеличением уровня GDNF и восстановлением способности к формированию памяти, то можно предположить наличие связи между ТШ и GDNF-опосредованной сигнальной трансдукцией.
Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу существования такой связи между GDNF и стрессорным воздействием при действии ТШ у исследуемых линий. GDNF локализуется с ядрами глиальных клеток и это позволяет предположить, что большая часть этого белка находится в глиальных клетках.
Но, поскольку интенсивность окраски антителами к GDNF до и после действия ТШ имеет различия у всех исследуемых линий, то значит количество GDNF тоже отличается.
В интактном контроле и у линий дикого типа Canton-S, Berlin, Oregon-R и у мутанта agnts3 GDNF располагается в мышечных и нервных клетках. Интенсивность окрашивания антителами к GDNF разная у исследуемых лини. У Canton-S и agnts3 в интактном контроле интенсивность окрашивания антителами к GDNF более низкая, чем у Berlin и Oregon-R, что свидетельствует о меньшем количестве этого белка в нормальных условиях у Canton-S и agnts3. Моделирование стрессорной ситуации происходило путем применения ТШ. После действия ТШ у линии дикого типа Canton-S GDNF локализуется вокруг ядер мышечных и глиальных клеток, вдоль нейритов и в нервно-мышечных контактах, но в ядрах клеток отсутствует. Однако у других линий дикого типа Berlin и Oregon-R район глиальных клеток менее обширен, чем зона НМК и нейрит и ядра не окрашены. Интенсивность окрашивания после ТШ у линий дикого типа Canton-S, Berlin и Oregon-R возрастает, т.е. увеличивается количество GDNF в ответ на стресс. У мутантной линии agnts3 после ТШ GDNF локализуется вокруг ядер мышечных, глиальных клеток и вдоль нейритов. Увеличивается интенсивность окраски, следовательно, увеличивается количество белка GDNF мутантной линии, но общий уровень ниже, чем у дикого типа.
Это свидетельствует о функциональной связи сетей трансдукции LIMK1 и GDNF, что влияет на синаптическую пластичность – основу процессов обучения и памяти.