2.4. Иммунофлюоресцентный анализ распределения gdnf
Приготовление нейромышечных препаратов для анализа распределения GDNF происходило аналогично таковому при иммунофлюоресцентном анализе распределения БТШ70.
В работе использовали первичные антитела GDNF rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology) и вторичные антитела Atto 565 donkey anti-rabbit (НПО "Биотехнологии").
2.5. Обработка полученных результатов
Aнализ и модификацию конфокальных изображений осуществляли с помощью программ для обработки изображений ImageJ, Fiji и GIMP. Эти программы являются системой видеотестов, способной обработать изображения, полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Результаты исследования
C использованием конфокальной микроскопии были получены результаты, которые приведены ниже. Для представления были отобраны микрофотографии, которые, по нашему мнению, наиболее полно отражают картину полученных результатов.
3.1.1. Распределение БТШ70 у линий дрозофилы с полиморфизмом по гену limk1 в норме
Благодаря использованию антител к HRP (horseradish peroxidase, пероксидаза хрена), специфичных плазматической мембране пресинаптической области нервной ткани мы осуществили идентификацию аксонов и их отростков после иммунофлуоресцентной детекции, а использование антител к БТШ70 позволило выявить локализацию БТШ70 в нервно-мышечных контактах у личинок исследуемых линий. Иммунофлуоресцентный анализ позволил нам получить комплексную картину локализации БТШ70 в нервно-мышечных контактах линии дикого типа Canton-S.
В интактном контроле Canton-S БТШ70 колокализуется с ядрами глиальных клеток (рис.19). Это позволяет предположить, что большая часть этого белка находится в глии.
Рис. 19 Локализация БТШ70 в нервно-мышечных контактах у линии Canton-S в норме. Х63. Суммарное изображение трёх слоёв – 3 мкм. Зеленый – антитела к HRP. Красный - антитела к БТШ70. Merge– сводное изображение HRP и БТШ70.
Рассмотрим распределение БТШ70 в нервно-мышечных контактах линии Oregon-R в норме (рис.20). У линии дикого типа Oregon-R БТШ70 локализуется вдоль нейритов, в глиальных клетках и в области НМК у поверхности мембраны. В ядрах БТШ70 не обнаруживается.
Рис. 20. Локализация БТШ70 в нервно-мышечных контактах у линии Oregon-R в норме. Х63. Суммарное изображение трёх слоёв – 3 мкм. Зеленый – антитела к HRP. Красный - антитела к БТШ70. Merge – сводное изображение HRP и БТШ70.
В интактном контроле в нервно-мышечных контактах у линии дикого типа Berlin БТШ70 локализуется вдоль нейритов, глиальных клеток и в области НМК равномерно по всему объёму клеток. В ядрах БТШ70 не обнаруживается (рис. 21).
Рис. 21. Локализация БТШ70 в нервно-мышечных контактах у линии Berlin в норме. Х63. Суммарное изображение трёх слоёв – 3 мкм. Зеленый – антитела к HRP. Красный - антитела к БТШ70. Merge – сводное изображение HRP и БТШ70.
В интактном контроле в нервно-мышечных контактах личинок мутантной линии agnts3 БТШ70 находится в НМК и колокализуется с ядрами глиальных клеток (рис. №22). Это позволяет сказать, что большая часть БТШ70 находится в глии.
Рис. 22. Локализация БТШ70 в нервно-мышечных контактах у линии agnts3 в норме. Х63. Суммарное изображение трёх слоёв – 3 мкм. Зеленый – антитела к HRP. Красный - антитела к БТШ70. Merge – сводное изображение HRP и БТШ70.
Однако интенсивность окраски у исследуемых линий разная (рис.23).
Рис. 23. Сравнение локализации БТШ70 в нервно-мышечных контактах у исследуемых линий в норме. Х63. Суммарное изображение трёх слоёв – 3 мкм. Зеленый – антитела к HRP. Красный - антитела к БТШ70. Merge – сводное изображение HRP и БТШ70.
Таким образом, в нервно-мышечных контактах исследованных нами личинок линий дикого типа Canton-S, Berlin, Oregon-R и у мутанта agnts3 БТШ70 в норме локализуется в глии. Различие в интенсивности окраски у мутанта и линий дикого типа свидетельствует о разном количестве БТШ70. У линии agnts3 интенсивность окраски антителами к БТШ70 меньше, чем у остальных линий, что свидетельствует о том, что и количество БТШ70 в норме у мутантной линии меньше.