Изолирование, обнаружение и определение 1,4-бензодиазепинов в биожидкостях.

(I ММИ им. И.М.Сеченова Б.И.Изотовым с сотр.). ХТА проводится по продуктам гидролиза - аминобензофенонам. Это позволяет определить общее кол-во препарата (как сумму нативного соединения и его метаболитов) в биожидкости. Xлордиазепоксид и его метаболит, АХБ (2-амино-5-хлорбензофенон), Диазепам, МХБ (2-метиламино, 5-хлор бензофенон), АХБ (2-амино. 5-хлоробензофенон); Оксазепам, АХБ; Нитразепам, ДАБ (2,5 диаминобензофенон), АНБ (2-аминоцтробензофенон); Феназепам, БХБ (2-амино,5-бром, хлораминобензофенон).

Методика. К 10 мл анализируемой мочи или 2 мл крови + соответственно 10 мл пли 2 мл конц. НС1 и нагревают в колбе или мерной пробирке с обратным холодильником на кипящей водяной бане 1 ч. По окончании гидролизат нейтрализуют насыщ. р-ром NaOH, доводят до рН 8-10 и экстрагируют дважды хлороформом (10 мл х 2 для крови). Слой орг. растворителя отделяют в делительной воронке, а затем в объединенных экстрактах упаривают орг.растворитель под струей теплого воздуха до объема в несколько капель для ТСХ-анализа и досуха для колич.определения.

ТСХ-очистка и обнаружение. Остаток экстракта и пятно метчиков, состоящее из смеси бензофенонов производных 1,4-бензодиазепина (10-15мкг каждого) переносят на стартовую линию ТСХ-пластинки «Силуфол» УФ-254. Пробег фронта растворителя - 10 см; подвижная фаза - бензол. Пластинку сушат. При концентрации бензофенонов (и, соответственно 1,4-бензодиазепинов) более 5 мкг/мл их м. обнаружить по собственной желтой окраске и флюоресценции в УФ-свете, при меньшим концентрациях - по флюоресценции в УФ-свсте и реакции окрашивания Браттона-Маршалла. Реакцию окрашивания проводят в след. последовательности: пластинку опрыскивают 0,1% NaNO₂, 2н НС1, через 1-5 мин – р-ром сульфата аммония (или насыщ. р-ра мочевины) и 0,1% α-нафтилэтилендиаминдихлорида или щелочным р-ром β-нафтола. Визуально регистрируют окрашенные пятна.

Количественное определение хлордиазепоксида, оксазепама, лоразепама, феназепама по 2-амино-бензофенонам и нитразепама по 2-амино-5-нитробензофенону проводят фотометрическим методом в видимой области спектра после реакции Браттона-Маршалла. Для расчета колич.содержания пользуются калибровочным графиком.

Построение калибровочного графика. В 3 мерные (калиброванные) пробирки на 5 мл + по 0,1 мл (100 мкг) стандартного р-ра анализируемого в-ва в спирте (1 мг/мл) и по 3 мл 2 н. HCl. Гидролиз проводят на глицериновой бане с обратным холодильником при 125-130С 30 мин или на кипящей водяной бане 60 мин. По окончании гидролиза холодильники промывают 1 мл 2 н. HCl. После охлаждения объем гидролизат доводят 2н. НС1 до 5 мл.

Далее, для каждого гпдролизата поступают след.образом. В мерные пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,5; 1 мл (2, 5, 10. 20 мкг соединения), доводят объем до 3 мл 2 н. HCl н проводят реакцию Браттона-Маршалла: + 1 мл 0,1% NaNO₂, через 5 мин - 0,5 мл 1% р-ра сульфата аммония. Полученный р-р встряхивают до полного удаления пузырьков газа, после чего + 1 мл 1% раствора α-нафтилэтилендиаминдихлорида, Оптическую плотность окрашенных р-ров измеряют через 15 мин на ФЭК56-М в кюветах на 10 мм, светофильтр зеленый, р-р сравнения - смесь реактивов для реакции Браттона - Маршалла (двойной объем). Полученные данные используют для построения калибровочного графика зависимости оптический плотности от концентрации.

Методика определения в биожидкостях. К 10 мл мочи (или 2 мл крови) + равный объем конц. HCl и проводят гидролиз по вышеописанной методике. По окончании реакции гидролизат подщелачивают конц. р-ром NaOH до рН 9 и экстрагируют дважды хлороформом (15 мл для мочи и 5 мл для крови). Хлороформный слой отделяют, орг.растворитель упаривают в токе теплого воздуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл 2 н. HCl, проводят реакцию Браттона-Маршалла и фотометрируют. Концентрацию анализируемых в-в определяют по калибровочным графикам.

Разработан высокочувствительный твердофазный ИФА гидазепама с хемилюминесцентным детектированием. Качественно-количественным методом определения бензодиазепинов в биообъектах является ВЭЖХ (на микроколоночном хроматографе «Милихром»).

Интерпретация результатов. При несмертельных отравлениях в крови и моче обнаруживаются препарат и его метаболиты, при средней степени отравления у детей обнаруживали 0,003 г/л в крови и 0,00153 г/л в моче, при тяжелом отравлении 0,008 г/л в крови и 0,0077 г/л в моче.

Через 1 год сибазон выявляется в виде АХБ(аминохлорбензофенона), основного продукта его разложения и гидролиза. Обнаружение АХБ и МХБ в сильно загнившем трупном материале не дает основания говорить об отравлении каким-либо конкретным бенздиазепином, извлекается из такого материала только подкисленным этанолом.