Определение 1,4-бензодиазепинов после гидролиза

Для проведения гидролиза могут быть использованы непосредственно ткани органов, хлороформные экстракты из подкисленных вытяжек и элюаты при применении сорбци- онного метода.

Определенный объем элюата или экстракта выпаривают досуха. К сухому остат­ку, навеске ткани органа, к 10 мл мочи или 2 мл крови прибавляют 2 мл 6 М раство­ра хлороводородной кислоты. Смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа или 5-10 мин на глицериновой (песчаной) бане при 120°С. При наличии в объекте про­изводных 1,4-бензодиазепина раствор окрашивается в желтый цвет за счет образования бензофенонов. К части гидролизата после охлаждения добавляют каплю 5% раствора нитрита на­трия, перемешивают. Несколько капель полученного раствора вносят в 2 мл свежеприго­товленного 2% щелочного раствора резорцина или В-нафтола - наблюдают образование вишнево-красного окрашивания или оранжево-красного осадка. Продукт гидролиза диазепама (2-метиламино-5-хлорбензофенон) не образует азокрасителя, так как имеет заместитель - метальную группу в положении 1. В присутствии диазепама раствор может сохранить желтую окраску. Вторую часть гидролизата осторожно подщелачивают 50% раствором гидроксида' натрия до рН=10-11 и экстрагируют гексаном. Гексановые экстракты выпаривают досуха при комнатной температуре, остаток растворяют в небольшом объеме этанола и исследу­ют с помощью ТСХ- и УФ-спектрофотометрии.

Хроматографию проводят на пластинках «Силуфол». В качестве подвижной фазы используют бензол, которым предварительно насыщают хроматографическую каме­ру в течение 10 мин. Раствор экстракта из гидролизата наносят на стартовую линию пластинки и одновременно в качестве «свидетелей» - бензофеноны, полученные при гидролизе стандартных веществ - бензодиазепинов (по 10-15 мкг каждого). После хро- матографирования бензофеноны первоначально фиксируют на пластинке по собствен­ному желтому окрашиванию. При просматривании пластинки в УФ-свете бензофеноны обнаруживают характерную флуоресценцию. Затем проводят непосредственно на пла­стинке реакцию Браттона-Маршалла. Хроматографическую пластинку последовательно опрыскивают 0,1% раствором нитрита натрия, 2 М раствором хлороводородной кислоты. Через 1-2 мин обрабатывают 2% щелочным раствором Р-нафтола. Флуоресцирующие пятна на пластинке окрашиваются в оранжево-красный цвет. Пятна 2-метиламино- 5-хлорбензофенона не переходят в красно-оранжевый цвет, но при обработке хромато- граммы 10% раствором хлорной кислоты дают яркую флуоресценцию в УФ-свете при 254 и 360 нм.

Предел обнаружения производных бензодиазепина составляет 1-5 мкг исследуемого вещества в пробе, нанесенной на пластинку.

УФ-спектрофотометрия используется после проведения TGX и элюирования бен- зофенонов с пластинки спиртом или ацетоном. Бензофеноны имеют характерную абсорб­цию в области 230-240 и 390-410 нм.

Оценка. Описанное исследование по 1 направлению имеет судебно-химическое зна­чение при получении отрицательного результата.

При получении положительных испытаний по 1 направлению проводят дальнейший анализ.

Определение индивидуальных производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов

Для обнаружения отдельных веществ и их метаболитов изолирование проводят путем на­стаивания слолярным растворителем и экстрагируют из водного раствора хлороформом при рН=2 и рН=10 или используют сорбционный метод на полимерных сорбентах с по­следующим элюированием исследуемых соединений с сорбента. Полученные экстракты (элюаты) упаривают до небольшого объема ~ 0,5-1 мл (концентрирование). Для обна­ружения производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов в полученном концентрате используют хроматографию в тонком слое сорбента, УФ-спектрофотометрию, газожид­костную, высокоэффективную жидкостную хроматографию и химический метод.

Хроматография в тонком слое сорбента. Часть раствора наносят в виде точки на стартовую линию хроматографической пластинки «Силуфол УФ-254». В качестве «стандартов» на пластинку наносят по 10-15 мкг растворов хлозепида, диазепама, нитра- зепама и оксазепама. Пластинку помещают в одну из систем растворителей: хлороформ - ацетон (90:10) или этилацетат - 25% раствор аммиака - уксусная кислота (26:1,6:3,3), позволяющих разделить бензодиазепины.

Для обнаружения бензодиазепинов на пластинке ее обрабатывают реактивами в опре­деленной последовательности. Пластинку опрыскивают раствором нингидрина и затем 5 мин нагревают при 100°С. Образуются пятна желтого цвета. При последующей об­работке реактивом FNP (смесь хлорида железа(Ш), хлорной и азотной кислот) желтые пятна приобретают голубой цвет. Эту же пластинку опрыскивают подкисленным йодпла- тинатом - пятна приобретают темный цвет.

Пластинку можно обработать реактивом Марки. Пятна бензодиазепинов окрашива­ются в желтый цвет.

Кроме того, можно дополнительно провести химическую реакцию образования азо- красителя после гидролиза бензодиазепинов и метаболитов на пластинке до аминобен- зофенонов.

Заключение о нахождении в извлечении конкретного производного 1,4-бензодиазе- пина по результатам ТСХ можно сделать, если цвет и R_f исследуемого вещества и «стан­дарта» полностью совпадают.

УФ-спектрофотометрия проводится после очистки экстрактов с помощью ТСХ, элюирования веществ с пластинки этиловым спиртом, 0,1 М раствором серной (хлоро­водородной) кислоты или смесью 1 М раствора хлороводородной кислоты и метилового спирта (1:9).

При регистрации спектра поглощения производные 1,4-бензодиазепина и их мета­болиты определяют по характерным максимумам и минимумам в спектре. Например, в растворе 0,1 М серной кислоты хлозепид обнаруживает 2 максимума при 245 и 306 нм, диазепам при 241, 284 и 359 нм, нитразепам при 277 нм.

Газожидкостная хроматография проводится с использованием колонок длиной 2 м и диаметром 4 мм на хромосорбе Q (80-100 меш.) с покрытием SE-30. Обнаружение бензодиазепинов и их метаболитов проводят по соответствующим индексам удержива­ния (см. табл. 22).

ИК-спектроскопия. Сухой остаток после испарения хлороформного экстракта или элюата растирают с кристаллами бромида калия и прессуют в виде диска. В ИК- спектре бензодиазепинов появляются интенсивные полосы за счет валентных колебаний ОН-, NH-, СО-, С-С- групп (см. табл.).

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Обнаружение произ­водных 1,4-бензодиазепина предложено проводить по нативным соединениям или бензо- фенонам. Методика включает следующие условия разделения веществ: жидкостный хро­матограф «Милихром»; хроматографическая колонка 62x2 мм; подвижные фазы - смесь 0,05 М водного гидрофосфата аммония и ацетонитрила 65:35 (для бензодиазепинов) и 45:55 (для бензофенонов); детектирование при 230 нм (для бензодиазепинов) и при 220 нм (для бензофенонов); скорость потока (элюирования) 100 мкл/мин.

Обнаружение производных 1,4-бензодиазепина по ИК-спектрам

Производное 1,4-бензодиазепина	Характеристические полосы в ИК-спектре, см4
Хлозепид	1625, 1458,760
Диазепам	1681, 1484, 1313
Оксазепам	1687,1706,693,830
Нитразепам	1692, 1615, 1352, 702

В указанных условиях удается четко разделить между собой все производные бен­зодиазепинов и бензофеноны. Для обнаружения исследуемых веществ сопоставляют время (объем) удерживания и коэффициенты емкости определяемых веществ и образцов сравнения - эталонных растворов бензодиазепинов и бензофенонов, а также УФ-спектры исследуемого компонента и образца сравнения при двух и более длинах волн, и оценива­ется их спектральное отношение (табл. 24).

Предел обнаружения бензодиазепинов методом ВЭЖХ составляет для оксазепама 3,4-10"⁶ мг, нитразепама 11,1 • 10"⁶ мг, хлозепида 17,8-10 ⁶, диазепама 15-10"⁶ мг в вводи­мой пробе.

Химический метод основан на использовании реакций, в результате которых образу­ются окрашенные продукты.

Реакция с нингидрином. К 2-3 мл раствора остатка или элюата в этиловом спирте прибавляют 10 мг нингидрина и 2 мин нагревают на водяной бане. Раствор окрашивается в синий цвет. При добавлении 1% раствора сульфата меди(П) окраска переходит в крас­ную или оранжево-красную (диазепам), в желто-коричневую (нитразепам), в коричневую (хлозепид).

Реакция гидролиза амидокарбинольной группы. Эта реакция используется для обнару­жения оксазепама (нозепама). К сухому остатку прибавляют 5 мл 96% этилового спирта и 4 капли концентрированной фосфорной кислоты. Смесь нагревают на кипящей водя­ной бане не менее 5 мин. Раствор охлаждают. К 1 мл полученного раствора добавляют 5 мл воды очищенной и 1 мл фуксинсернистой (хромотроповой) кислоты - наблюдают появление фиолетового окрашивания. В результате гидролиза амидокарбинольной груп­пы образуется формальдегид, который с фуксинсернистой кислотой (или хромотроповой кислотой) дает характерное окрашивание.

Уравнения реакций между формальдегидом, фуксинсернистой и хромотроповой кис­лотами приведены в разделе 9.4.2.

Реакция с реактивами Марки и Фреде. При нанесении на сухой остаток в фарфоро­вой чашке, полученный при испарении хлороформного экстракта или элюата, реактива Марки или реактива Фреде, хлозепид образует желтое окрашивание.