Особенности хта на наличие 1,4-бензодиазепинов по нативным соединениям и их метаболитов.

О. отравления 1,4-бензодиазепинами встречаются нечасто. Однако при постановке заданий по ХТА представленных объектов экспертиза составляет определенные трудности, связанные с тем. что эти препараты в организме подвергаются разрушению и образуются различные метаболиты. При этом основными продуктами распада 1,4-бензодиазепинов являются 2-амино-5-(различно-замещенные)-бензофеноны, которые трудно дифференцировать и идентифицировать. Ниже приводим методические рекомендации Изотова Б.Н. и Волковой И.В. (1988) для демонстрации сложностей исследований биообъектов на соединения данной группы.

ХТА состоит их 2 этапов: I. по продукту гидролиза хлордиазепоксида и его метаболитов - 2-амино-5-хлорбензофенону. II. по нативному хлордиазепоксиду и его метаболитам.

Пределы обнаружения и определения при ХТА на каждом из этапов представлены в таблицах №.

Пределы обнаружения хлордиазепоксида в деструктатах органов (этап I).

Добавлено к 25г биообъекта	Обнаружено		Определение по реакции образования азокрасителя
	ТСХ	УФ-спектр	мкг	%
500	+++	++	310	62
200	+++	+-	130	65
100	+++	+-	60,5	60,5
50	++	-	33,5	67

Пределы обнаружения хлордиазепоксида и метаболитов при изолировании подкисленной водой (этап II)

Доб-но к 25г биооб-та, мкг	Обнаружено
	Печень		Желудок		Кишечник
	ТСХ	УФ-	ТСХ	УФ-	ТСХ	УФ-
300	++	+-	+++	+-	+++	+-
200	+-	-	+++	-	+++	-
100	+-	-	++	-	++	-
50	-	-	+	-	-	-

Исследованию по 1 этапу придается отрицательное значение в ХТА. Положительный результат исследования в этом направлении указывает на присутствие производных 1,4-бензодиазепина: хлордиазепоксида, оксазепама и диазепама, образующих в процессе гидролиза 2-амино-5-хлор-бензофенон. Результаты исследования по 2 этапу позволяют идентифицировать хлордиазепоксид.

Колич. определение хлордиазепоксида и его метаболитов проводят по 2-амино-5-хлор-бензофеноиу. Методика анализа.

I. Гидролиз. К 25г (средняя проба) из 100 г гомогенизата каждого органа (печень, стенки желудка и кишечника), помещают в колбы, вносят по 50 мл 6 н. HCl и гидролизуют на глицериновой бане с обратным холодильником при 125-135°С 1 ч (печень) или 80-100 мин (желудок и кишечник). По окончании гидролиза холодильники промывают 5 мл. 2 н. HCl и промывные воды присоединяют к гидролизату. Горячий гидролизат фильтруют через ватмановский фильтр (белая лента) Остаток на фильтре трижды промывают 2 н. НСl и + гранулированный NaOH, не допуская при этом сильного разогревания гпдролизата. Устанавливают рН 6-8 по универсальному индикатору (при значениях рН выше 9 образуется стойкая эмульсия).

2. Экстракция. Гидролизат экстрагируют смесью хлороформа и изоамилового спирта (100:1) трижды по 20,_; 15 и 15 мл. После добавления каждой порции экстрагента содержимое делительной воронки встряхивают 5 мин. Образовавшуюся эмульсию помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 мин при 4-5 тыс. об/мин. Орг.фазу переносят в мерные колбы на 50 мл через воронку с безводным сульфатом натрия (0,5г) Объем р-ра доводят до метки и перемешивают (V₁).

3. Обнаружение. ТСХ-разделение. 1/5 и 2/5 части извлечения - V₂ выпаривают под током теплого воздуха. Остатки переносят с помощью хлороформа на «Silufol» в виде двух полос длиной в 1 и 3-4 см на расстоянии 1,5 см друг то друга. На ту же стартовую линию, рядом, наносят пятна метчика: смесь 0,1% спиртовых р-ров бензофенонов 1,4-бензодиазепина (МХБ-диазепам, АНБ-нитразепам, АБХБ-феназепам, АХБ-хлордиазепоксид) по 10-15 мкг каждого. Подвижная фаза - бензол. Пробег фронта растворителя - 10 см.

Часть хроматограммы, содержащую 2/5 части исследуемого р-ра, предназначенную для элюирования, закрывают стеклянной пластинкой. На открытой части хроматограммы с пятном метчика и второй полосой исследуемого р-ра (1/5 часть извлечения) проводят реакцию образования азокрасителя: хроматограммы обрабатывают последовательно 2н HCl, 0,1% NaNO₂ и через 5 мин – 0,5% сульфаматом аммония или насыщенным р-ром мочевины и 0,1% N-1-нафтилэтилендиаминдихлорида или щелочной р-р β-нафтола. Величины Rf бензофенонов приведены в таблице Удается обнаруживать 1 мкг хлордиазепоксида в пятне.

Не обработанную реагентом зону сорбента вырезают и помещают в пробирку с 5 мл этанола (V₃), взбалтывают 3-5 мин, переносят в кювету (1см) и снимают спектр в области 200-500 нм.

Значения величин R_f и λ_max продуктов гидролиза производных 1,4-бенздиазепина.

Соединения	Продукт гидролиза	Значения Rf (подвижная фаза бензол)	УФ-спектры (λ)
Нитразепам	2амино-5-нитробензофенон 2,5-диаминобензофенон	0,17 0,18 старт	'738, 358
Феназепам	2-амино-5хлор-бробензофенон	0,43 0,15	230, 400
Диазепам	2-метиламино-5-хлорбензофенон 2-амино-5-хлорбензофенон	0,57 0,35 0,37	238, 410 238, 390
Хлордиазепоксид	2-амино-5-хлорбспзофенон	0,35 0,37	238, 390

4. Количественное определение хлордиазепоксида. В зависимости от концентрации 2-амино-5-хлорбензофенона, которую ориентировочно рассчитывают после снятия УФ-спекгра, отбирают часть элюата (V₄) и переносят в бюкс. Этанол удаляют под током теплого воздуха. Сухой осгаток растворяют в 0,2-0,5 мл этанола и + до 3 мл 2 н HCl. Далее последовательно - 0,5 мл 0,1% NaNO₂, через 5 мин - 0,5 мл 0,5% сульфамата аммония. После добавления каждого реагента р-р интенсивно взбалтывают. Азокраситель сиреневого света образуется через 15 мин после добавления 1 мл 0,1% N-1-нафтилэтилендиаминдихлорида. Окраски устойчива 24ч.

Оптическую плотность окрашенного р-ра измеряют на СФ или ФЭКе при 550 нм в кювете 1 см.

Концентрацию хлордиазепоксида в органах определяют по формуле, где х – кол-во выделенного соединения в мг на 100г органов, А - оптическая плотность измеряемого р-ра. E_{1 см} – уд. показатель поглощения (220). Др. буквенные обозначения указаны в тексте.

Определение уд.показателя поглощения. В 3 калиброванные мерные пробирки (для 3 повторных определений) на 5 мл вносят по 0.1 мл (100 мкг) стандартного спиртового р-ра хлордиазепоксида (1 мг/мл), + по 3 мл 2 н. HCl и гидролизуют 30 мин на глицериновой бане при 125-135°С с обратным холодильником. По окончании гидролиза холодильник промывают 1 мл 2 н. HCl и после охлаждения гидролизата доводят последний до 5 мл. Из каждого гидролизата в мерные пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,5, 0,75, 1 мл (2, 5, 10, 15, 20 мкг в-ва), доводят 2 н. HCl до 3 мл и проводят реакцию образования азокрасителя как указано выше. После определения плотности окрашенного р-ра при 550 нм уд.показатель поглощения вычисляют по формуле, где D - оптическая плотность р-ра; С - концентрация р-ра в весовых %, 1 - толщина поглощающего слоя в см. В качестве р-ра сравнения используют смесь реактивов. Подчинение закону Бутера наблюдается в пределах концентрации 5-20 мкг в исследуемой пробе. (Определение содержания хлордиазепоксида по бензофенону, основанное на получении азокрасителя с β-нафтолом, проводить нельзя ввиду отсутствия характерного спектра поглощения).

Исследование по нативному соединению с метаболитами (этап 2). Объекты ХТА на содержание хлордиазепоксида совместно с метаболитами являются печень, стенки желудка и кишечник.

Методика анализа. 1. И:юлирование_: 25 г мелко измельченных органов (средняя проба из 100г) заливают в стакане на 200 мл 0,5 н. HCl (рН 1) и оставляют при комн. тем-ре 1 ч, периодически перемешивая и проверяя значение рН среды. Настаивание повторяют 2 раза при тех же условиях. Извлечения объединяют, процеживают через тонкий тампон в делительную воронку на 250 мл и устанавливают рН 3 по универсальному индикатору. Экстрагируют хлороформом трижды по 15 мл. В случае образования эмульсии разделение фаз достигалось центрифугированием извлечения 10 минут при 5000 об/мин. Орг. фазу переносят в мерную колбу на 50 мл, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия, доводят хлороформом до метки и перемешивают. Извлечение исследуют на содержание хлордиазепоксида и метаболитов: демоксепама, десметилхлордиазепоксида и дезоксидемоксепама.

2. ТСХ. На стартовую линию ТСХ-пластинки наносят остаток 1/5 части извлечения, растворенный в миним. кол-ве хлороформа. На расстоянии 2 см от первой точки наносят с виде полос 1 см этанольные р-ры (1 мг/мл) хлордиазепоксида и его 3 метаболитов. Хроматографируют в камере с системой растворителей этилацетат-абс. этанол (9:1). Пробег растворителя 10 см. По удалении растворителя с сорбента ТСХ-пластинку обрабатывают конц. НС1 до полного увлажнения слоя силикагеля. Накрывают покровным стеклом, избегая прилипания влажною сорбента к покровному стеклу; термостатируют при 135-140°С. Через 20 мин покровное стекло снимают, а хрома-тограмму оставляют в термостате еще на 5 мин. После охлаждения пластинки слой сорбента обрабатывают последовательно реагентами для образования азокрасителя. При наличии хлордиазепоксида и его метаболитов образуются пятна сиреневого цвета, значения R_f которых представлены в таблице №.

Одновременно с первой ТСХ-пластинкой в эту же камеру помещают вторую, на стартовую линию которой наносят полосой 1,5 см остатки из 2/5 и 1/5 части извлечений В третью полосу, длиной 1см, наносят в качестве метчика смесь стандартных р-ров (1 мг/мл) хлордиазепоксида и его метаболитов. Пластинку сушат, зону сорбента, соответствующую 2/5 извлечения, фиксируют стеклянной пластинкой. Остальную часть хроматограммы обрабатывают последовательно реактивом Драгендорфа (модификация Hachebout) и 10% H₂SO₄. При наличии хлордиазепоксида и его метаболитов наблюдаются пятна оранжево-красного цвета. Зону сорбента, соответствующую 2/5 части извлечения, параллельную проявленным пятнам, снимают, помещают на стеклянный фильтр (№ 4) и элюируют ацетоном дважды по 5 мл в мерную пробирку.

3. Фотометрия в УФ-области спектра. В подученных элеатах удаляют орг. растворитель, сухие остатки растворяют в 5 мл этанола и снимают спектры поглощения в УФ-области в интервале 200-400 нм против 96° этанола. Измерение в тех же условиях повторяют после добавления в кювету, включая и р-р сравнения, по 3 кап насыщенного р-ра NaOH. После снятия спектра в щелочной среде в те же кюветы + по 5 кап конц. H₂SO₄ и получают спектр в кислой среде. Результаты исследования представлены в таблице №.

3. Хроматографическая очистка. При отсутствии характерных спектров соединений по причине влияния эндогенных в-в необходимо удалить последние, используя хроматографирование полученных элюатов в метаноле. Спиртовые р-ры элюатов после снятия спектров упаривают и сухие остатки наносят на стартовую линию ТСХ-пластинки полосой 1 см. Рядом наносят 1/5 часть хлороформного извлечения. Хроматографируют в камере, насыщенной в течение 15 мин метанолом, до поднятия растворителя на 10см. После удаления растворителя под током теплого воздуха зону сорбента, соотв. 1/5 части извлечения, обрабатывают реактивом Драгендорфа и 10% H₂S0₄. Параллельно проявленным пятнам снимают сорбент в зоне расположения нанесенного элюата. Помещают на стеклянный фильтр № 4 и элюируют дважды по 5 мл ацетоном (время настаивания по 10 мин).

При исследовании хлордиазепоксида по 2-амино-5-хлорбензофенону определяется 60,5±4,3% -70,0±1,2% от введенного кол-ва, что зависит от характера анализируемого объекта: степень извлечения значительно снижается при наличии эндогенных соединений липидной структуры. При исследовании по нативному соединению и метаболитам слепень извлечения хлордиазепоксида и его метаболитов находится в интервале от 552,2% до 62±2,8%.

Значения R_f и спектральные характеристики хлордиазепоксида и его метаболитов.

Вещества	Значения Rf (система мэтилацетат-абс. спирт (9: 1))		УФ-спектры (λ), спирт, кислота, щелочь
Хлордиазепоксид	0,32	24 265 310	245 310	245 265
Демоксепам	0,62	238 308	238 308	242 305 355
Десметилхлордиазепоксид	0,2	240 310	248 310	240 260
Дезоксидемоксслам	0,75	230	238 285 355	232 340

Селективность метода исследования хлордиазепоксида.

Селективность анализа хлордиазегюксида по продукту гидролиза-2-амино-5-хлорбензофенону установлена по отношению к л­карственным соединениям, указанным в таблице №, что надо учитывать при подозрении комбинированного отравления.

Таблица . Значение R_f лекарственных препаратов, имеющих ароматическую аминогруппу, в системе этилацетат-спирт (9:1)

Соединение	В вытяжке из р-ра
	кислого	щелочного
Оксазепам Диазепам Нитразепам	0,7 0,78 0,76	0,70 0.78 0,76
Анестезин	-	0,93
Стрептоцид Сульгин Сульфадиметоксин Сульфадимезин Этанол	0,7 0,3; 0,85 0,82 - 0,65	0,7 0,3 0,82 0,2; 0,7 -
Парааминобензойная к-та Парааминосалициловая к-та	0,82 0.85	- -

Производные 1,4-бснзодиазепина в сочетании с метаболитами осложняют проведение анализа в этом направлении. Однако следует упомянуть, что метаболиты оксазепама (в основном глюкурониды) не экстрагируются хлороформом из водного извлечения, переходит в орг.фазу только нативное соединение. Поэтому при наличии оксазепама, в отличие от хлордиазепоксида, на хроматограмме появляется лишь одно окрашенное пятно, Rf которого 0,7-0,72. Т.обр., селективность анализа при ХТА хлордиазепоксида по бензофенону отсутствует в отношении оксазепама.

Обнаружение хлордиазепоксида в объектах, подвергшихся гнилостному разложению, при ХТА по продукту гидролиза (АХБ) не вызывает затруднений. 70-85% хлордиазепоксида удастся обнаружить при хранении объектов в течение года. Отрицательное влияние продуктов гнилостного разложения объектов при ХТА неизмененного хлордиазепоксида и его метаболитов (II этап) проявляется через 3 нед с момента наступления смерти. При более поздних сроках хранения исследование сводится к анализу продукта гидролиза - 2-амино-5-хлорбензофенона (1 этап). В случае обнаружения последнего эксперт в своем заключении указывает на присутствие в объектах ХТА производных 1,4-бензодиазспина, продуктом гидролиза которых м.б. 2-амино-5-хлорбензофенон.

Получение метаболитов и приготовление стандартных р-ров. Для приготовления стандартного р-ра 0,050 г растворяют в 96° спирте, объем р-ра доводят в мерной колбе до 50 мл (1 мг/мл).

Демоксепам (7-хлор-5-фенил-ЗН-1,4-бензодиазепин-20Н-4-оксид) получен из 7-хлор-2-(метилацетамид)-5-фснил-3-1,4-бснзодиазепин-4-оксида: к 0,25 мл р-ра последнего + при комн.тем-ре 250 мл 1 н. HCl.

Через 14 ч смесь подщелачивают и экстрагируют равным кол-вом эфира дважды (для очистки). Продукт реакции остается в водном щелочном р-ре, который нейтрализуют уксусной кислотой и экстрагируют метиленхлоридом. Орг.растворитель удаляют, полученный остаток перекристаллизовывают из петролейного эфира. Выход 89%. Чистое в-во в виде пластинок, растворим в щелочах с образованием кристаллических солей. Чистоту определяют ТСХ в системе этилацетат-абс. cпирт (9:1). Полученное соединение используют для приготовления стандартного р-ра: 0,050 г депоксепама растворяют в 96° спирте и объем р-ра доводят до 50 мл (1 мг/мл).

Дезоксидемоксепам (7-хлор-5-фенил-ЗН-1.4-бснзодиазепина-20Н) получают из 14,3 г демоксепама, растворенного в 300 мл диоксана. Гидрируют в присутствии 20 г никеля Ренея под давлением при норм.тем-ре до поглощения 1 М водорода. Полученную соль фильтруют и концентрируют, упаривая под вакуумом до минимального объема. Остаток растворяют в диэгиловом эфире пли петролейном эфире. После перекристаллизации из ацетона образуются бесцветные пластинки. Выход 92%. Чистоту полученного препарата определяют ТСХ в системе этилацетат-абс.cпирт (9:1). Для приготовления стандартного р-ра растворяют 0,050 г полученного соединения в 96 спирте и объем р-ра доводят в мерном колбе до 50 мл (1 мг/мл).

2-амино-5-хлорбензофенон (АХБ). К измельченным таблеткам хлордиазепоксида в круглодонных колбах для гидролиза + 10 мл 6 н. HCl и гидролизуют на глицериновой бане при 120-130°С 30 мин. По охлаждении гидролизат нейтрализуют гранулированным NaOH и устанавливают рН 10. Экстрагируют равным объемом хлороформа дважды. Орг.растворитель удаляют на роторном испарителе. Остаток подвергают очистке в ТСХ (подвижная фаза бензол). Участок сорбента, содержащий 2-амино-5-хлорбензофенон (окрашенный в желтый цвет), элюируют ацетоном по 5 мл 4 раза. Орг.расворитель удаляют и остаток высушивают до постоянного веса при 70°С. Кристаллический порошок желтого цвета с т.плав. 96,5°С. 0,050т 2-амино-5-хлор-бензофенона (точно), помещенного в мерную колбу на 50 мл растворяют в 96° спирте и объем доводят до метки (1 мг/мл).

Десметилхлордиазепоксид (7-хлор-2-амино-5-фенил-3Н-1,4-бензодиазепина-5) суспензию, состоящую из 40 г 6-хлор-2-хлорметил-4-фенилхинозолин-3-окси и 400 мл 15% спиртового р-ра аммиака, перемешивают при комн.тем-ре 5ч, осадок фильтруют, промывают водой или эфиром (до удаления аммиака и орг.примесей). Выход препарата 60% . Т.плав. соединения после перекристаллизации из метанола- 255-256°C. 0,050 г его растворяют в 96° спирте и доводят до 50 мл (1 мг/мл).