Цветные реакции на белки и аминокислоты

Ход определения.

Реакция	Номер пробирки	Ход работы	Окраска	Чем обусловлена
Биуретовая	1	Раствор I - 5капель, 10%-ный раствор NaOH - 5 капель,1%-ный раствор СuSО4 - 1 капля
	2	Раствор II - 5капель, 10%-ный раствор NaOH - 5 капель,1%-ный раствор СuSО4 - 1 капля
Нингидриновая	1	Раствор I - 5капель, 1%-ный раствор нингидрина в ацетоне- 2 капли; нагревают
	2	Раствор II - 5капель, 1%-ный раствор нингидрина в ацетоне- 2 капли; нагревают
Ксантопротеиновая	1	Раствор I - 5капель, HNO3(конц.)- 3 капли ; осторожно нагревают
	2	Раствор II - 5капель, HNO3(конц.)- 3 капли ; осторожно нагревают
Фоля	1	Раствор I - 5капель, , 30%-ный раствор NaOH - 5 капель,5%-ный раствор(СН3СОО)2Рb-1 капля; нагревают до кипения
	2	Раствор II - 5капель, 30%-ный раствор NaOH - 5 капель,5%-ный раствор (СН3СОО)2Рb-1 капля; нагревают до кипения

1. с помощью биуретовой реакции определяют наличие пептидных групп в олигопептидах и в белках (универсальная реакция для любых белков);

2. с помощью нингидриновой реакции определяют наличие a-аминогрупп в свободных аминокислотах, а также в аминокислотах олигопептидов и белков (универсальная реакция для любых белков);

3. с помощью ксантопротеиновой реакции определяют наличие в белках ароматических аминокислот;

с помощью реакции Фоля определяют наличие аминокислоты- цистеина

1. Качественная реакция на каталазу

2. Качественная реакция на каталазу

3. Ход определения. Действие каталазы крови (вместо крови можно использовать слюну, которая содержит небольшое количество каталазы). В две пробирки берут по 1 мл воды, добавляют по 2 капли крови и одну пробирку кипятят 2-3 минуты для начала инактивации ферментов. После охлаждения в обе пробирки добавляют 5-10 капель перекиси водорода, встряхивают и наблюдают за выделением пузырьков кислорода. При встряхивании кипяченой пробы выделение пузырьков не происходит.

Качественная реакция на молочную кислоту

Принцип метода. Молочная кислота в присутствии фенолята железа (реакция Уффельмана), окрашенного в фиолетовый цвет, образует лактат железа желто-зеленого цвета.

Ход определения. Мышцы измельчают ножницами и растирают 1 грамм их в ступке в течение 3 минут, прибавив 5 капель воды до получения гомогенной массы. Затем приливают 3 мл воды, перемешивают, сразу же фильтруют через смоченную водой вату, 25 капель фильтрата добавляют по каплям к реактиву Уффельмана (20капель 1% раствора фенола + 2 капли 1% раствора хлорного железа до появления фиолетового цвета). В присутствии молочной кислоты фиолетовая окраска жидкости переходит в желто-зеленую, так как образуется лактат железа. Для сравнения проводят реакцию Уффельмана с раствором молочной кислоты и наблюдают появление желто-зеленого окрашивания

Определение содержания бета- и пре-бета-липопротеинов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай

Принцип метода. Метод основан на способности гепарина образовывать с бета- и пре-бета-липопротеинами сыворотки крови комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок. Степень помутнения раствора пропорциональна содержанию этих липопротеинов в сыворотке крови.

Ход определения. В контрольную и опытную кюветы КФК с толщиной слоя 0,5 см наливают по 2 мл хлорида кальция. Устанавливают шкалу прибора на нулевую отметку при 720 нм (красный светофильтр). В опытную кювету приливают микропипеткой 0,2 мл сыворотки, несколько раз промывая пипетку. Отмечают исходное значение экстинкции (Е₁). Затем добавляют микропипеткой 0,04 мл гепарина, несколько раз промывая ее, и перемешивают содержимое кюветы. Ровно через 4 минуты (по секундомеру) вновь измеряют экстинцию (Е₂).

Расчет. Содержание бета- и пре-бета-липопротеинов х (г/л) в сыворотке крови определяют по формуле:

х = (Е₁-Е₂) *11,65,

где 11,65-эмпирический коэффициент пересчета содержания бета- и пре-бета-липопротеинов на г/л.

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции рассчитать содержание определяемых липопротеинов в сыворотке крови и сделать вывод о возможных их изменениях.

Практическое значение работы. В норме содержание бета- и пре-бета-липопротеинов в сыворотке крови составляет 3,6-6,5 г/л. Наиболее часто наблюдается увеличение содержания бета-липопротеинов в сыворотке крови. Оно тесно связано с повышением содержания холестерина в крови, так как им наиболее богаты бета-липопротеины. Повышение бета- и пре-бета-липопротеинов имеет место при заболеваниях, связанных с нарушением липидного обмена (атеросклероз, сахарный диабет и др.). Уровень их изменяется при нарушении функции печени (гепатиты).