Глава 5. Общая характеристика биотехнологического процесса

Основу промышленного производства продуктов биосинтеза со­ставляет единая биотехнологическая система (БТС), которая включает основные компоненты, взаимодействующие между собой в определен­ном режиме посредством соответствующей аппаратуры (рис. 7).

Основные технологические стадии биотехнологического процесса включают:

1. Приготовление и стерилизацию питательных сред;

2. Приготовление посевного материала;

3. Культивирование;

4. Обработку культуральной жидкости;

5.Выделение и очистку биопрепарата;

6. Получение готовой продукции.

К определяющим факторам биотехнологического процесса относят: вид используемого биотехнологического процесса; субстрат с его биохимическими и биофизическими характери­стиками;

аппаратурное оформление, включая систему контроля управле­ния;

технологический режим; соответствие требованиям gmp.

Для получения коммерческих препаратов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов двух областей — молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молеку­лярных биологов - идентификация, изучение свойств, модификация нужных генов, создание эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, используемых для промышленного синтеза соответ­ствующего продукта. Задача биотехнологов - обеспечить условия оп­тимального роста рекомбинантного микроорганизма с целью получения целевого продукта с наибольшим выходом.

5.1. Состав питательной среды

Состав питательной среды должен быть оптимальным, так как это определяет размножение, рост микроорганизмов и синтез различных БАВ. Питательные среды могут быть сложными, включающими до 50 компонентов и более, и достаточно простыми, содержащими не бо­лее 5 компонентов.

Назначение питательных сред:

поддержание оптимальных для роста клеток физико-химичес­ких условий (рН, еН, рО₂, рСО₂, и т.д.);

обеспечение клеток питательными веществами для синтеза биомассы и других продуктов жизнедеятельности. Понятие «среда для культивирования» включает не только опреде­ленный качественный и количественный состав компонентов или от­дельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетиче­ского обмена организма (источники азота, углерода, фосфора, ряда микроэлементов, витамины, ростовые вещества), но и физико-химические и физиологические факторы (кислотность, окислительно-восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы играют существенную роль в развитии микроорганизмов и в проявлении ими отдельных физиологических и биохимических функ­ций. Обычно изменение одного из этих факторов среды влечет измене­ние других. Значительного повышения выхода нужного продукта, обра­зуемого микроорганизмами, достигают, используя методы математиче­ского расчета соотношения компонентов субстрата и их свойства. Питательные среды принято делить на две группы:

1) среды, требующие внесения 5-20% природных сывороток (из крови человека или эмбриональных экстрактов крупного рога­того скота);

2) синтетические химические среды определённого состава.

Качественная характеристика компонентов питательной среды

Основу питательных сред составляют смеси аминокислот, пуринов, пиримидинов, участвующих в синтезе белков и нуклеиновых кислот.

Сыворотки (эмбриональная сыворотка крови, лошадиная сыворот­ка или очищенный экстракт куриных эмбрионов), их высокомолекуляр­ные фракции (а-, Р-глобулины) предохраняют клетки от повреждения и стимулируют синтез ДНК. Синтез последних индуцируют и ростовые факторы (митогены) - вещества пептидной природы. В качестве источ­ника углерода и энергии используется глюкоза или ее комбинации с аспарагиновой или молочной кислотами. Для развития микроорганиз­мов необходимы витамины жиро- и водорастворимые. Жизнедея­тельность микроорганизмов невозможна без наличия в цитоплазме кле­ток и окружающей среде неорганических соединений, содержащих та­кие элементы, как фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо, марга­нец, цинк, медь, молибден и др. Микро- и макроэлементы входят в состав ферментов, участвуют в поддержании необходимого осмотиче­ского давления и значения рН, буферной ёмкости (фосфатно-бикарбонатные буферы) или регулируют гидрофильность цитоплазмы клетки.

Фосфор входит в состав важнейших соединений клетки - нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полифосфатов, фосфолипидов.

Соединения серы участвуют в энергетических процессах клетки, входят в состав многих физиологически активных соединений (белок и простетические группы (-SН) некоторых ферментов и коэнзима А). Без серы невозможен полноценный синтез белка, нарушаются процессы обмена. Обычно источником серы служат неорганические сульфаты, поэтому для включения серы в состав белков или витаминов сульфат должен быть восстановлен с помощью ферментов (сульфитредуктазы, сульфурилазы, пирофосфатазы). Наиболее важным серосодержащим компонентом клетки является аминокислота цистеин.

Калий в организме выполняет, прежде всего, каталитическую роль, выступая в качестве активатора некоторых ферментов (амилазы, инвертазы), способствуя увеличению гидратации цитоплазмы клетки.

Ионы кальция регулируют активную кислотность (рН среды), вы­ступают в качестве реагента, связывающего остатки фосфорной кисло­ты.

Основная функция магния - активация ферментов, необходимых Для нормального обмена веществ и роста микроорганизмов.

Микроэлементы (железо, медь, цинк, марганец, молибден, кобальт и др.) входят в состав ферментов, участвующих в процессах метаболиз­ма и внутриклеточного обмена. Каталитическая активность микроэле­ментов возрастает во много раз, когда ионы металлов соединяются с молекулами органических веществ и образуют органоминеральные комплексы (хелаты). Железо входит в состав ферментов-активаторов кислорода — системы цитохромов. Медь в сочетании со специфически­ми белками образует ряд ферментных систем (полифенолксидазы, ас-карбинооксидазы, нитратредуктазы, альдегидоксидазы и др.) Цинк уча­ствует в построении фосфатаз, эналаз, полипептидаз, регулирующих углеводный, азотистый, фосфатный обмены ряда организмов, в окисли­тельно-восстановительных процессах. Составной частью многих фер­ментных систем (карбоксилаз, протеиназ, фосфорилаз) является марга­нец, так фосфорилазы участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Определенное влияние на различные стороны ме­таболизма микроорганизмов и особенно антибиотиков оказывает ко­бальт.

Среда содержит также небольшие концентрации антибиотиков для поддержания асептических условий.

Перечисленные компоненты достаточно дороги, поэтому при круп­номасштабном производстве прежде всего углеводы заменяют более доступными по стоимости продуктами крахмалопаточного производст­ва (мелассой, гидролом, кукурузным экстрактом, соевой мукой, свекло­вичным жомом).

Незаменимым элементом питательных сред является вода, которая составляет единую систему с элементами клетки. Вода-растворитель способствует проникновению в клетку необходимых веществ и выводу из нее продуктов обмена. В клетках вода находится и в виде соединений с углеводами, белками и другими веществами, тесно взаимодействуя с макромолекулами клетки. Гидратирование и дегидратирование органи­ческих молекул — важнейший этап в превращении химических компо­нентов цитоплазмы. Вода участвует в реакциях гидролиза и конденса­ции, поддерживает объёмную структуру клетки при наличии гидроста­тического давления.

Для питательных сред используют специально подготовленную во­ду. Очистка воды проходит 4 стадии:

1) удаление механических загрязнений на префильтре (пористое стекло, электрокоагуляция);

2) очистка от органических загрязнений (активированный уголь);

3) деионизация с использованием ионообменных смол (катиониты, аниониты);

4) стерилизация на мембранных фильтрах с размером пор от 0,22 до

0,45 мкм.

Для стерилизации питательных сред используют термическую сте­рилизацию (пар под давлением) и стерилизующую фильтрацию. Цель стерилизации питательных сред - разрушение бактериальных спор. Многие компоненты питательных сред (витамины, гормоны и другие БАВ) крайне чувствительны к длительному температурному воздейст­вию, поэтому установлены специальные режимы периодической и не­прерывной термической стерилизации питательных сред. Стерилизую­щая фильтрация предполагает использование мембранных фильтрую­щих элементов.