- •1.Загальна теорія поглинання світла молекулами.
- •2.Апаратура для вимірювання поглинання у видимому та ультрафіолетовому світлі.
- •2.1Спектрофотометри
- •3. Методика спектрофотометричних вимірювань
- •4.Фактори, що впливають на абсорбціонні властивості хромофора.
- •5.4Приклад 4. Асоціація білка .
- •6.Поглинання поляризованого світла.
- •7. Інфрачервона спектроскопія
- •7.1 Методика вимірювань
- •7.2Інформація, що міститься в інфрачервоних спектрах
3. Методика спектрофотометричних вимірювань
Існує два типи спектрофотометрів: однопроменеві і двопроменеві. У однопроменевий приладі промінь світла, що виходить з монохроматора, проходить через одну кювету і потім потрапляє в детектор. Визначення поглинання роблять у такий спосіб. Спочатку прилад встановлюють на нуль проникання(нескінченна величина поглинання) з детектором в темряві, що робиться для компенсації слабкого струму, який є навіть за відсутності випромінювання і виникає внаслідок емісії теплових електронів. Потім в промінь поміщають кювету, що містить розчинник, і прилад встановлюється для вимірювання в одиницях проникнення (нуль поглинання) при певній довжині хвилі. Після чого, кювету з розчинником замінюють кюветою з розчином досліджуваної речовини і виробляють вимір.За цією методикою вимірюють два фотоструми - один пропорційний інтенсивності променя, що пройшов через розчинник, і другий - пропорційний інтенсивності променя, що пройшов через розчин речовини. Щоб співвідношення цих струмів були еквівалентні проникності, треба джерело випромінювання і детектор залишати постійними в межах, коли проникність встановлена на одиницю і коли проникність зменшується при вимірюванні поглинання речовини. Отже, особливу увагу необхідно звертати на постійну напругу, що подається на лампу.У двохпроменевій спектрофотометрії ця проблема вирішена наступним чином. Випромінювання, що виходить з монохроматора, розділяється на два промені, що мають однакові інтенсивності і спектральні розподіли. Один з променів проходить через кювету з розчинником, інший - через кювету з досліджуваним речовиною. На відношення випромінювань, що виходять з обох кювет, величина джерела світла не робить ніякого впливу. Ставлення випромінювань може бути виміряна двома способами.Промені, що вийшли з кювет, спрямовуються на катоди двох фотоемісійних ламп або фотопомножувач. Виходи цих детекторів пов'язані серією опорів, посилюють різницю між двома фотоструму і реєструють величину поглинання. Зручністю двопроменевих приладів є можливість реєстрації показань.У приладах з одним детектором промені, що виходять з двох кювет, спрямовуються на ту ж частина катода однієї лампи. За допомогою обертового непрозорого диска промені розбиваються на окремі порції. Таким чином, на детектор падає випромінювання, інтенсивність якого змінюється в межах I і I0, і його вихід змінюється з тією ж швидкістю, що і швидкість обертання диска. Це створює напругу, амплітуда якого буде пропорційна різниці в інтенсивності двох променів. Подальше вимір напруги, відповідного інтенсивності променів, залежить від конструкції приладу.Зазвичай для отримання спектрів потрібно від 0,1 до 100 мг речовини в залежності від молярного коефіцієнта поглинання. Розчини, що застосовуються в спектрофотометрії, є дуже розведеними, що обумовлює необхідність точного зважування зразка і точного відмірювання розчину при наступних розведеннях. Підходящої для вимірювань концентрацією є та, яка забезпечує показання поглинання між 0,2 і 0,7, що відповідає проникнення від 65 до 20%.Певне підвищення точності спектрофотометричного аналізу досягається шляхом, так званої диференціальної фотометрії. Цей метод заснований на порівнянні поглинання невідомого розчину і поглинання стандартного розчину, останній підібраний таким чином, що різниця в поглинаннях буде знаходитися в межах, в яких вимір може бути виконано з достатньою точністю. Диференціальний спосіб прийнятий Скандинавської фармакопеєю в якості основного методу для спектрофотометричних визначень.Відповідно до одного з варіантів диференціального методу, званого іноді ДЕ або Δε методом, вимірювання проводиться шляхом порівняння. Невідомої речовини при певній величині рН до тієї ж концентрації речовини, але при іншій, відмінній від першої, величиною рН. Наприклад, для визначення фенолів розводять частина розчину лужним, буфером, а іншу частину кислотним буфером. Вимірюють поглинання лужного розчину, використовуючи для порівняння кислотний розчин. Розраховують вміст фенолів, застосовуючи ДЕ значення, знайдене для чистої речовини в тій же парі буферних розчинів.Таким чином визначається зміст гексахлорофен в рідкому милі по Фармакопеї США XVII. Так як ряд речовин не показує змін до спектральних характеристиках при зміні рН, диференційний метод для фенолів можна вважати більш специфічним, ніж хімічний метод.