28. Реакция иммобилизации (ри)

Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.

Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса. 

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (рн)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция.

Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки - это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.

Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток - в геле (по Оухтерлони).

Реакция нейтрализации вирусов (рнв)

В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.

Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.

К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.

Цитологический тест информативен при изучении патогенетических механизмов. Тем не менее возможности его использования довольно ограничены, учитывая сложность методов клеточного культивирования. Цитотоксические реакции могут быть опосредованы антителами (активация комплемента), клетками-киллерами и сенсибилизированными Т-лимфоцитами. 

29. Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченных флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченное флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген — антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспресс-диагностика г Иммуноферментные, или энзим-иммунологические, методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Чтобы обнаружить соединение меченых антител с антигеном, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к lgG ферментом, с окрашиванием в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфатаза) цвет. Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции появляется свечение. Подобно иммунофлюоресценции иммуноферментный метод применяют для обнаружения антигенов в клетках или титрования антител на антигенсодержащих клетках.риппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.

Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченный радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. Если к такой антисыворотке добавить материал, содержащий искомый гормон, то он свяжет часть антител, при последующем внесении меченого титрованного гормона с антителами свяжется уменьшенное по сравнению с контролем его количество. Результат оценивают по сопоставлению кривых связанной и несвязанной радиоактивной метки. Эта разновидность метода носит название конкурентной реакции. Существуют и другие модификации радиоиммунологического метода.

30. Регуляторные Т-лимфоциты - центральные регуляторы иммунного ответа. Основная их функция — контролировать силу и продолжительность иммунного ответа через регуляцию функции Т-эффекторных клеток (Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток). Модулируя силу и продолжительность иммунного ответа через регуляцию активности Т-эффекторных клеток, регуляторные Т-клетки поддерживают толерантность к собственным антигенам организма и предотвращают развитие аутоиммунных заболеваний. Существуют несколько механизмов супрессии: прямой, при непосредственном контакте между клетками, и дистантный, осуществляющийся на расстоянии — например, через растворимые цитокины.

CD4⁺ T-клетки. Функциональная специализация CD4⁺ T-лимфоцитов более разнообразна. Значительная часть CD4⁺ T-лимфоцитов в процессе развития иммунного ответа становится T-хелперами (помощниками), взаимодействующими с В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами и другими клетками при концентрации Са²⁺ гранулы с перфорином (фиолетовые овалы) и гранзимами (жёлтые кружочки) сливаются с клеточной мембраной. Освободившийся перфорин встраивается в мембрану клетки-мишени с последующим образованием пор, проницаемых для гранзимов, воды и ионов. В результате клетка-мишень лизируется

прямом контакте или через растворимые факторы (цитокины). В определённых случаях из них могут развиться CD4⁺ ЦТЛ: в частности, такие T-лимфоциты обнаружены в значительных количествах в коже больных с синдромом Лайелла

При прямом механизме супрессии Treg взаимодействуют с эффекторными Т-клетками и секретируют гранзим B, который при помощи перфоринов вызывает апоптоз клеток, элиминируя активные Т-лимфоциты

Регуляторные Т-лимфоциты (Трег) - центральные регуляторы иммунного ответа. Основная их функция — контролировать силу и продолжительность иммунного ответа через регуляцию функции Т-эффекторных клеток. Эти Т-лимфоциты экспрессируют FOXP3 — транскрипционный фактор, регулирующий транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов и других факторов, участвующих в супрессии иммунного ответа. Различают несколько разных типов регуляторных Т-клеток: естественные Т-регуляторные клетки (T-reg1) и индуцибельные Т-регуляторные клетки (iT-reg). Индуцибельные Т-регуляторные клетки образуются под влиянием различных факторов на периферии, например, в региональных лимфатических узлах.

31. Th1-опосредованный или клеточный иммунный ответ

При этом типе иммунного ответа доминирует секреция ИФНу, приводящая к активации макрофагов и стимуляции секреции В-лимфоцитами антител со свойствами опсонинов. Важную роль в Th1-ответе играют ЦТЛ и NK-клетки, что важно не только для противоинфекционного, но и для противоопухолевого и трансплантационного иммунитета.

Условия развития иммунного ответа Th1-типа

• Зрелые ДК осуществляют контроль за Т-клеточной дифференцировкой в зависимости от типа патогена, пути заражения, наличия сигналов от клеток врождённого иммунитета и тканевых факторов. В случае контакта с внутриклеточными бактериями, вирусами или паразитами миелоидные ДК, вступив в контакт с Т-лимфоцитами лимфатических узлов, начинают продуцировать ИЛ-12 и ФНОα, стимулируя T-лимфоциты к выработке ИФНγ. ИЛ-12 продуцируют также макрофаги и нейтрофилы.

• На T-лимфоците, TCR которого связал антиген с высокой авидностью, устойчиво экспрессируется рецептор для ИЛ-12, содержащий β2-субъединицу (экспрессия этой субъединицы специфична именно для Th1).

• Плазмоцитоидные ДК сразу после распознавания патогена (ещё до попадания в лимфатический узел) начинают активно продуцировать интерфероны типа I (ИФНα и ИФНβ), которые, с одной стороны, аутокринно стимулируют созревание ДК, с другой - индуцируют образование T-лимфоцитами ИФНγ и ИЛ-10, а не одного только ИФНγ, как ИЛ-12 миелоидных ДК. ИЛ-10 подавляет дифференцировку и активность Th1-лимфоцитов, возможно, не напрямую, а через угнетение активности макрофагов и возникающий при этом недостаток ИЛ-12.

• ИФНγ и ИФНα - кофакторы для дифференцировки Th1лимфоцитов, индуцируемой ИЛ-12. Их источником, помимо Th1-клеток, служат активированные CD8⁺ T-клетки, т.е. CD8⁺ Т-лимфоциты вносят свой вклад в дифференцировку CD4⁺ T-клеток по пути Th1.

• В свою очередь, Th1-хелперы стимулированные ДК, активируют цитотоксические CD8⁺ Т-лимфоциты и макрофаги, которые «расправляются» с клетками организма, заражёнными внутриклеточными патогенами.

Th2-опосредованный или гуморальный иммунный ответ

• Иммунный ответ Th2-типа контролируется другими цитокинами, чем Th1-ответ, - в основном ИЛ-4. Продуценты ИЛ-4 - CD4⁺ Тh2-клетки, дважды негативные CD4^-CD8^- T-лимфоциты, тучные клетки. Этот тип ответа направлен на стимуляцию В-лимфоцитов к образованию антител, нейтрализующих бактерии, токсины, паразитов и реализующих другие эффекты гуморального иммунитета.

• Th2-лимфоциты поддерживают переключение синтеза изотипов иммуноглобулинов в B-лимфоцитах на IgE, IgG4 и IgА. Клеткипартнёры для этих изотипов - тучные клетки, базофилы и эозинофилы. При их активации развиваются воспалительные процессы с выраженным вазоактивным компонентом и экссудацией или характерное эозинофильное воспаление.

• За исключением патологических случаев IgE-зависимых аллергических реакций иммунный ответ Th2-типа принято (достаточно условно) рассматривать как противовоспалительный.

Условия развития иммунного ответа Th2-типа

Этот вариант иммунного ответа направлен на «перехват» растворимых компонентов патогенов (токсинов, аллергенов, химиопрепаратов), опсонизацию и фагоцитоз бактерий и вирусов, а также на элиминацию крупных инвазивных патогенов - гельминтов, которые не могут быть фагоцитированы макрофагами из-за своих размеров. При этом активация цитотоксических лимфоцитов не сообразна, и приоритет получает стимуляция B-лимфоцитов к продукции антител. Лидирующая роль в дифференцировке Т-хелперов в направлении Th2 отводится плазмоцитоидным ДК.

32. Основными индукторами клеточно-опосредованного иммунного ответа и ассоциированных с ним воспалительных реакций являются Th1-цитокины , к которым относятся IL-2 , IL-12 , интерферон-гамма ( IFN-гамма ) и фактор некроза опухолей альфа. Клеточный иммунитет играет важную роль в следующих реакциях. а. Аллергические реакции замедленного типа (например, туберкулиновые пробы), аллергический контактный дерматит. б. Защита против внутриклеточных паразитов. в. Противовирусный и противогрибковый иммунитет. г. Отторжение трансплантата. д. Противоопухолевый иммунитет.

34. Использование: в области медицины и касается выявления в организме человека активированных T-лимфоцитов. Сущность изобретения: проводят забор крови из пальца или вены в пробирки с антикоагулянтом, выделяют лимфоциты, полученные лимфоциты используют для постановки спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана без холодовой инкубации ("немедленные розетки") и по количеству лимфоцитов, прикрепивших более 10 эритроцитов барана, определяют активированные. Способ позволяет повысить объективность оценки, упростить определение и сократить времена анализа функциональной активности лимфоцитов, непосредственно в организме человека.

35. Клеточная цитотоксичность - важный механизм защиты против внутриклеточно локализованных возбудителей, таких как вирусы, некоторые бактерии и простейшие. Цитотоксическую активность могут проявлять несколько типов клеток - антигенспецифические цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), нормальные киллерные клетки (НК) и иногда К-клетки миелоидного ряда . ЦитоТоксическиеЛимфоциты защищают организм от внутриклеточных патогенов: вирусов, некоторых бактерий, паразитов, а также от опухолевых клеток. В физиологических условиях, т.е. в норме, цитотоксичность клеток иммунной системы направлена на разрушение и элиминацию стареющих и поврежденных клеток, таким образом обеспечивая клиренс многоклеточного организма от отживших клеток и продуктов их распада.

37. Реакция клеточной цитотоксичности. При совместном культивировании лимфоцитов реципиента (отвечающих клеток) и отличающихся от них по антигенам HLA класса II стимулирующих клеток среди отвечающих клеток появляются цитотксические Т-лимфоциты. Они способны разрушать клетки-мишени, несущие антигены, которые присутствуют на стимулирующих клетках. Изучение клеточной цитотоксичности в смешанной культуре лимфоцитов в ряде случаев позволяет предсказать, будет трансплантат стимулировать образование цитотоксических Т-лимфоцитов или нет. Для этого готовится смешанная культура лимфоцитов, где отвечающими клетками служат лимфоциты реципиента, а стимулирующими - инактивированные лимфоциты донора. После 6 суток инкубации смешанной культуре лимфоцитов к отвечающим клеткам добавляют свежие клетки того же донора, меченные 51Cr. Клетки реципиента и меченые клетки донора смешиваются в соотношениях 100:1, 50:1 и 10:1. После инкубации в течение 4 ч отбирают надосадочную жидкость и измеряют в ней содержание радиоактивной метки, вышедшей из разрушенных клеток донора. Отрицательным контролем служат меченые клетки донора. Метод можно использовать как до, так и после трансплантации. В последнем случае повышении активности цитотоксических Т-лимфоцитов свидетельствует об отторжении трансплантата.

38. В конце XIX столетия было установлено, что сыворотка крови содержит некий «фактор», обладающий бактерицидными свойствами. В 1896 году молодой бельгийский ученый Жюль Борде, работавший в Институте Пастера в Париже, показал, что в сыворотке имеются два разных вещества, совместное действие которых приводит клизису бактерий: термостабильный фактор и термолабильный (теряющий свои свойства при нагревании сыворотки) фактор. Термостабильный фактор, как оказалось, мог действовать только против определённых микроорганизмов, в то время как термолабильный фактор имел неспецифическую антибактериальную активность. Термолабильный фактор позднее был назван комплементом. Термин «комплемент» ввёл Пауль Эрлих в конце 1890-х годов.

Система комплемента — это сложный комплекс белков сыворотки крови, который является одним из компонентов неспецифического иммунитета и активируется по типу ферментативно-каскадной реакции,т.е. продукт предыдущей реакции играет роль катализатора следующей.

Система комплемента состоит из девяти основных белков и трех ингибиторов. Компоненты системы комплемента обозначаются прописной буквой С с порядковыми номерами от 1 до 9. Фрагменты, образующиеся в процессе расщеплении компонентов комплемента, обозначаются порядковыми номерами с малыми буквами (С2а, СЗЬ и т. д.). Ферментолитически активную форму обозначают штрихом сверху над указанием компонента комплемента. Если активированный фрагмент дезактивируется, то для обозначения этого добавляется буква i. Система комплемента циркулирует в крови в неактивном состоянии. Ее активация может осуществляться по классическому, или иммунному, пути и альтернативным способом (посредством белка пропердина).  

Функции системы комплемента: •    усиление процессов фагоцитоза путем выделения веществ, покрывающих патогенны или иммунные комплексы; •    участие в воспалительных реакциях путем влияния на интенсивность выделения базофилами биологически активных веществ; •    цитотоксическая функция, которая проявляется в образовании мембраноатакующего комплекса из поздних компонентов комплемента.