25. Методы оценки гуморального иммунитета1. Методы первого уровня основаны на доказательстве взаимодействия в системе антиген-антитело. - тест конъюгации. При этом маркируют один из реагентов, результаты оценивают по его связыванию с другими реагентами на основании физических или химических свойств конъюгата (прямая иммунофлюоресценция, иммунопероксидазный метод, ауторадиография);  - тесты, основанные на изменении свойств одного из реагентов (например, изменение флюоресценции, электрического потенциала, вязкости раствора; синтез соединений с более высокой молекулярной массой, изменение ферментативной активности антигенов). Эти тесты обладают ограниченными возможностями;  - тесты, основанные на отделении комплекса антиген-антитело от несвязанных реагентов с помощью техники высаливания, преципитации, использования специфических антител или адгезии на клеточной поверхности. К ним следует отнести большинство радио- и иммуноферментных методов.  2. Методы второго уровня основаны на более сложном характере взаимодействия между антигеном антителом. При этом механизмы преципитации, агглютинации и т. д., лежащие в основе комплекса, в большей степени, чем при методах первого уровня, зависят от рН, ионной силы и других условий реакции. К методам второго уровня относятся следующие реакции: преципитация, агглютинация, реакция связывания комплемента. Промежуточное положение между методами первого и второго уровней занимают исследования на изолированных клетках, например цитолиз или феномен освобождения медиаторов с участием эозинофилов.  3. Методы третьего уровня позволяют оценивать результаты реакции антиген-антитело в тканях или в организме в целом. В качестве примеров можно назвать модель анафилаксии in vitro (реакция Щульца-Дейла) и тестирование аллергенов с помощью кожных проб. Реакции, основанные на феномене агглютинации. Антиглобулиновый тест (реакция Кумбса). Тест потребления антиглобулина (тест Штеффена). Реакция связывания комплемента.

Реакция иммунного гемолиза и цитотоксический тест. Тест нейтрализации

26. Антиген — антитело реакция

Антиген — антитело реакция — специфическое взаимодействие антител с соответствующими антигенами, в результате которого образуются комплексы антиген — антитело (иммунные комплексы). Часто конечным результатом этой реакции является связывание токсинов, обездвиживание вирулентных бактерий, нейтрализация вирусов. Антигенсвязывающие центры молекулы антитела могут связывать несколько неродственных антигенов. Такие антигены обладают структурным сходством и носят название перекрестно реагирующих. Гомогенная популяция молекул антител может связывать различные молекулы с очень малым структурным сходством или вовсе несхожие. В этом случае говорят о мультиспецифическом связывании, которое объясняют образованием связей в различных участках внутри антигенсвязывающих центров.

    Реакция антиген — антитело протекает в две фазы, которые различаются между собой по механизму и скорости. Первая фаза — специфическое соединение активного центра антитела с соответствующими группами антигена или гаптена (см. Антигены);вторая — неспецифическая фаза, следующая за первой, — визуально наблюдаемая реакция. При взаимодействии антител с простыми гаптенами вторая фаза, как правило, отсутствует. При некоторых условиях, например в отсутствие солей, первая фаза может осуществиться, а вторая — нет. Первая фаза протекает всегда быстро, а вторая иногда очень медленно.

    Соединение антигена с антителом обратимо; прочность соединения, называемая аффинитетом, может быть количественно измерена с помощью определения константы ассоциации. Существует также термин авидности антител, который употребляется для описания суммарной силы взаимодействия поливалентного антитела с полидетерминантным антигеном.

   

    27. Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.