Lektsia_1_kultury_rastitelnykh_kletok_2012_nov

Протопласты растительных клеток как объект биологического конструирования

•Способы получения протопластов

•Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной

оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ.

•Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием

ферментов.

•Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для

каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

-обработка ферментами, растворенными в осмотике

-выделение протопластов из клеточных

стенок,

•- отделение интактных протопластов от 31

клеточных осколков.

Протопласты растительных клеток как объект биологического конструирования

•Способы культивирования протопластов

•Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования.

•В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на чашки Петри.

•Во втором - суспензию протопластов наливают в чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС. Так протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:

-видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения,

-способ и условия выделения протопластов,

Культуры in vitro тканей растений

•Образовавшиеся на эксплантах каллусные дедифференцированные клетки, при воздействии соответствующих концентраций фитогормонов или регуляторов роста (синтетических фитогормонов) могут начать дифференцироваться.

•Типы дифференцировки клеток растений in vitro

•Дифференцировка клеток может проходить различными путями и с различной степенью – от дифференцировки отдельных клеток до развития отдельного растения.

•Простой вид – появление в каллусной ткани дифференцированных клеток, имеющих специфическое строение и несущих особые функции, например, клеток депонирующих запасные вещества или метаболиты.

•Гистологическая дифференцировка – образование в каллусе различных тканей, например, элементов сосудистой системы.

•Органогенез (монополярные структуры) – дифференциация каллусных клеток в целые органы: превращение их в апексы стеблей или корней.

•Соматический эмбриогенез (биполярные структуры) – образование в каллусной культуре эмбриоидов, т.е зачатков интактного растения, способных развиться во взрослое растение.

33

Культуры in vitro тканей растений

• Различные типы

регенерации в культуре тканей:

• А) через эмбриоиды;

• Б) микроклонирование

меристем (органная культура);

• В) органогенез;

• Г) через протопласты

36

Культуры in vitro тканей растений

Схема, показывающая клонирование моркови через стадии

дедифференциации, формирования каллуса и роста эмбриоидов

38

Соматический эмбриогенез

Основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые

по своему виду напоминают зиготические зародыши.

Соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге развиваются в проросток.

39