Lektsia_1_kultury_rastitelnykh_kletok_2012_nov
.pdf
A B C
Индукция каллуса :
(A) из зрелых семян (B) корневых сегментов of Oryza sativa L. cv. Fujisaka
(C) каллус, сформировавшийся на корневых волосках
Genotypic Effects on Callus Morphology
Arabidopsis Tobacco
3.0 mg/L 2,4-D
2.0 mg/L IAA
3.0 mg/L 2-iP
0.1 mg/L kinetin
3.0 mg/L 2,4-D
Compact Callus |
Friable Callus |
|
Суспензионные культуры растительных клеток
Суспензионные культуры, растут в виде суспензии, то есть в жидкой питательной среде. Клетки тяжелее окружающей их жидкости, поэтому, чтобы они не затонули и не задохнулись, использовав весь растворенный кислород, их надо постоянно перемешивать. Такие культуры обычно выращивают в колбах, на специальных качалках. Частота вращения качалки тоже важна – с одной стороны необходимо добиться перемешивания, а с другой – не вызвать
механический стресс.
Суспензионные культуры -
отдельные |
|
клетки |
или |
группы |
|
клеток, |
|
выращиваемые |
во |
||
взвешенном |
состоянии в |
||
жидкой среде. Представляют |
|||
собой |
|
относительно |
|
гомогенную |
популяцию |
||
клеток, |
которую |
легко |
|
подвергнуть |
воздействию |
||
химических |
веществ. |
Их |
|
получают, |
|
помещая |
|
каллусную ткань в колбу с
жидкой |
питательной |
средой |
|
и |
затем |
длительно |
|
перемешивают |
на |
качалке, |
|
удаляя |
при |
пересадках |
|
крупные агрегаты. |
23 |
||
|
|
|
|
Суспензионные культуры растительных клеток
Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке
метаболизма и и высокая скорость
размножения в конкретных условиях культивирования. Морфологические характеристики такой линии:
- высокая степень дезагрегации (5-10 клеток
в группе); - морфологическая выравненность клеток
(небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
- отсутствие трахеидоподобных элементов.
25
Суспензионные культуры растительных клеток
В исследованиях по изучению роста
растительных суспензионных культур обычно проводят определение веса сырого и сухого вещества клеток, их количества, объема уплотненных клеток, размера клеток, их среднего объема, содержания белка.
Как правило, клеточная популяция суспензионных культур асинхронна и содержит клетки. различающиеся по времени вхождения
в митоз, Кроме того, клеточная популяция в
значительной степени гетероплоидна, что может мешать синхронизации делений растительных клеток.
26
Суспензионные культуры растительных клеток
Одним из основных параметров культуры клеточных суспензий является минимальное время удвоения клеточной популяции, которое может составлять в накопительной культуре 22-96 часов в то время, как продолжительность клеточного цикла делящейся меристемы растений – всего 8-20 часов.
Для клеточной культуры моркови время удвоения популяции составляет 48 часов.
28
Культивирование отдельных клеток
•Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности, а также для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий.
•Культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани.
•Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных
клеток мезофилла листа и целой ткани.
•
29
Культивирование отдельных клеток
•Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов:
•1) изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани;
•2) создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной
клетки.
•На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани. Этого можно достичь путем обработки ткани пектиназами, что ведет к мацерации ее клеток. Однако не всегда после такой обработки клетки сохраняют способность к последующим
делениям и образованию ткани. Лучше получать отдельные клетки из
суспензионных культур или рыхлого каллуса.
•Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку.
•Далее клетки изолируют либо при помощи микроманипуляторов, либо путем
ряда последовательных разведений.
•Отдельные клетки вели себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды и требуются специальные добавки к питательной среде, чтобы заставить их делится.
30