Занятие №18

ГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №18 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Лабораторная диагностика кишечных инфекций. Возбудитель холеры.

2.Цели занятия: Изучить со студентами методы лабораторной диагностики кишечных инфекций, свойства возбудителя холеры, факторы патогенности и патогенез холеры, клинические проявления, методы диагностики, профилактики и лечения холеры.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение методов лабораторной диагностики кишечных инфекций.

3.2.Изучение свойств холерного вибриона.

3.3.Изучение факторов патогенности и патогенеза холеры.

3.4.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения холеры.

3.5.Выполнение самостоятельной работы.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1.Методы лабораторной диагностики кишечных инфекций.

5.2.Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства холерного вибриона.

5.3.Факторы патогенности возбудителя и патогенез холеры.

5.4.Методы диагностики, профилактики и лечения холеры.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка

I. Лабораторная диагностика кишечных инфекций

Лабораторная диагностика кишечных инфекций регламентирована санитарно-эпидемиологическими правилами СП 3.1.1.1117-02 “Профилактика кишечных инфекций”. В соответствии с этими правилами лабораторному обследованию подлежат лица с подозрением на острые кишечные инфекции, лица, контактировавшие с больными, работники отдельных профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по эпидемическим показаниям, секционный материал при наличии прижизненного диагноза острой кишечной инфекции (ОКИ).

3

В качестве исследуемого материала для лабораторной диагностики используют фекалии, кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, остатки пищевых продуктов. Материал для лабораторного исследования собирают в стерильную стеклянную посуду. Срок доставки материала в лабораторию не должен превышать 2 часов. При невозможности своевременной доставки материала в лабораторию используют консервант или транспортную среду. При этом материал помещается в холодильник и направляется на исследование не позднее 12 часов после сбора.

Лабораторная диагностика кишечных инфекций включает в себя получение чистой культуры возбудителя, изучение ее морфологических и тинкториальных свойств, биохимической активности, фагочувствительности, серологических характеристик. Для этого на 1-ом этапе исследования производят посев культуры на дифференциально-диагностические питательные среды (Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфитный агар). На 2-ом этапе проводят выделение чистой культуры (пересев на скошенный МПА, среду Олькеницкого). На 3-ем этапе проводят идентификацию выделенной культуры по микроскопической картине, биохимической активности, серологическим свойствам (в реакции агглютинации). На 4-ом этапе учитывают результаты исследования и выдают заключение.

Для этиологической расшифровки ОКИ дополнительно в качестве вспомогательных могут быть использованы люминесцентный, молекулярногенетический и другие методы.

Транспортные среды для энтеробактерий:

1.Физраствор.

2.Глицериновый раствор (консервант) или буфер.

3.Фосфатно-буферный раствор.

4.Среда Эймса (соли, агар, уголь) без угля.

5.Среда Кери-Блейра (соли и агар).

6.Среда Стюарта.

Среды для выделения и идентификации энтеробактерий (рекомендованы ВОЗ, 1990):

1.Базовые среды: - кровяной агар;

- агар на переваре сои.

2.Селективные и дифференциально-диагностические среды: - ацетатный агар; - пептонная вода с Андреде; - среда Клиглера; - агар Мак-Конки;

- SS-агар;

- цитратный агар Сименса.

Среда Клиглера (2 сахара – глюкоза и лактоза) позволяет судить о

ферментации углеводов, образовании сероводорода (среда чернеет) и образовании газа (разрыв среды).

Трехсахарный агар по Олькеницкому (сахароза, глюкоза, лактоза,

мочевина, соли) позволяет судить о продукции уреазы (красный цвет), ферментации

4

сахаров (желтый цвет), продукции сероводорода (черный цвет), образовании газа (разрыв среды).

Сахаролитические свойства (ферментация углеводов):

1.Среды Гисса – 1% пептонная вода + 0,5% углевода + индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH). Среда бесцветная, рН 7,2-7,4. при ферментации углевода – красный цвет.

2.Полужидкие среды с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты). Нейтральный рН – среда бесцветная; кислая среда – синяя окраска; щелочная среда – красная окраска.

3.Короткий пестрый ряд – среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом.

Протеолитические свойства:

1.Разжижение 10-20% желатины.

2.Образование аммиака в пептонной воде (посинение розовой лакмусовой

бумаги).

3.Образование индола:

- способ Эрлиха: в пробирку с культурой добавляют 2-3 мл эфира и реактив Эрлиха (спиртовый раствор параметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). При наличии индола отмечается розовое окрашивание;

- реактив Ковача (изоамиловый спирт + диметиламинобензальдегид + серная кислота) → красный цвет;

- индикаторная бумажка, пропитанная щавелевой кислотой (способ Мореля)

→окрашивание бумаги в розовый цвет.

4.Образование сероводорода:

–среда со смесью солей (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия) – почернение агара;

- индикаторная бумажка с ацетатом свинца → черный цвет.

Дифференциально-диагностические среды:

1.Среда Эндо (МПА + лактоза + фуксин + сульфит натрия) – бледно-розовый цвет. Разложение лактозы → образование ацетилальдегида → кислая рН → взаимодействие с сульфитом натрия → восстановление фуксина → красное окрашивание колоний (с металлическим блеском).

2.Среда Левина (МПА + лактоза + метиленовый синий + эозин + калия гидроортофосфат) – красно-фиолетовый цвет. Ферментация лактозы → изменение рН → колонии темно-сине-фиолетового (черного) цвета с зеленым блеском. Не ферментирующие колонии – бесцветные или розоватые.

3.Среда Плоскирева или бактоагар Ж (МПА + желчные кислоты + йод + бриллиантовый зеленый + нейтральный красный) – коричневато-красный цвет. Рост лактозоположительной кишечной палочки → изменение рН → колонии брусничного цвета.

II. Возбудитель холеры

Холера – особо опасное инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae, протекающее по типу гастроэнтерита с интоксикацией и нарушением водно-электролитного обмена. В связи с тем, что для нее характерны резко

5

выраженная способность к широкому эпидемическому распространению, тяжелое течение и высокая летальность, холера относится к числу опасных инфекций.

Историческая справка. В истории холерных эпидемий можно выделить 4 периода. I период - до 1817 г., когда холера была сосредоточена только в Восточной и Южной Азии (главным образом в Индии) и не выходила за ее пределы. II период - с 1817 г. по 1926 г. холера вышла за пределы Индии и вызвала 6 пандемий, которые унесли миллионы человеческих жизней. Например, за 1823-1926 гг. Россия пережила 57 холерных лет, в течение которых холерой переболело более 5,6 млн. человек и умерло от нее 2,14 млн. человек (около 40%). III период - с 1926 г. по 1961 г. Холера вернулась в свой основной эндемический очаг, и наступил период относительного благополучия. IV период начался в Индонезии в 1961 г. седьмой пандемией, охватившей многие страны мира. С 1961 по 1996 г. холерой в 146 странах переболело 3 943 239 человек.

Классификация возбудителя. Возбудитель холеры Vibrio cholerae был открыт в 1883 г. Р. Кохом. Вид V. cholerae относится к роду Vibrio семейству Vibrionaceae отделу Cracilicutes. В настоящее время известны следующие биотипы возбудителя холеры:

-V. cholerae О1 cholerae (классический), выделенный Р. Кохом в Гонконге в 1883 г. от больного;

-V. сholerae eltor, изолированный от мусульманских паломников в 1906 г. на карантинной станции Эль-Тор а Египте;

-V. cholerae О139 bengal, выделенный в 1993 г. в индийском штате Западная Бенгалия от больных во время крупной вспышки диарейной инфекции.

Эпидемиология. Холера - типичная кишечная инфекция. Природный резервуар и источник инфекции - больные и бактерионосители, а также вода, загрязненная их выделениями. Основной механизм передачи - фекалъно-оралъный, редко контактный. Факторы передачи - пищевые продукты, вода, объекты окружающей среды. Пути заражения - основной - через воду, используемую для питья, купания и хозяйственно-бытовых нужд, через пищу. Животные холерой не болеют.

Обильная диарея, характерная для холеры, способствует широкому распространению возбудителя в окружающей среде, прежде всего в сточных водах и

воткрытых водоемах. Человек, больной холерой, выделяет возбудителя в количестве от 100 млн. до 1 млрд. в 1 мл испражнений, вибриононоситель выделяет с испражнениями 100-100000 вибрионов в 1 мл. Продолжительность выделения холерного вибриона у бактерионосителей составляет от 7 до 42 дней.

Морфологические и тинкториальные свойства. V. cholerae представляют собой изогнутые подвижные палочки. Подвижность холерного вибриона связана с наличием одного жгутика (монотрих). Жгутик снабжён чехликом и продольным выростом, напоминающим ундулирующую мембрану. Подвижность холерных вибрионов является важным диагностическим признаком.

Палочки грамотрицательные, короткие, не образуют спор и капсул. Диаметр палочек 0,5 мкм, длина 1,5-4,0 мкм. Вибрионы хорошо окрашиваются анилиновыми красителями.

Культуральные свойства. Для выделения холерного вибриона чаще всего используют щелочной МПА. На плотных питательных средах возбудитель холеры

6

образует небольшие круглые дисковидные прозрачные колонии S-формы с ровными краями, голубоватые в проходящем свете. При посеве уколом в столбик желатина вибрион через 48-72 часа при 22-23°С вызывает воронкообразное разжижение.

В жидких средах вибрион вызывает помутнение и образование нежной голубоватой плёнки на поверхности, её края приподняты вдоль стенок пробирки; при встряхивании пленка легко разрушается и оседает на дно. На 1% пептонной щелочной воде (рН 8,6-9,0) холерный вибрион через 6-8 часов образует нежную голубоватую плёнку и умеренную муть. Пептонная вода с добавлением 0,5-1% NaCl является наилучшей средой накопления для возбудителя холеры. Оптимальная температура выращивания составляет 37°С.

Биохимические свойства. Холерные вибрионы сбраживают с образованием кислоты многие углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, лактозу, гликоген, крахмал и др.). Ферментация маннозы, сахарозы и арабинозы (так называемая триада Б. Хейберга) имеет диагностическое значение. Холерные вибрионы обладают плазмокоагулирующим (свёртывают плазму кролика) и фибринолитическим (разжижают свёрнутую сыворотку) свойствами, свёртывают молоко, сероводорода не образуют, восстанавливают нитраты и образуют индол.

Антигенная структура. У холерных вибрионов выделяют термостабильные О- и термолабильные Н-антигены.

По структуре О-антигена холерные вибрионы относится к группе О1 и О139. О-антиген О1-группы холерных вибрионов неоднороден и включает А, В и С компоненты, по которым и различают три серотипа - серотип Огава (АВ), серотип

Инаба (АС) и серотип Гикошима (АВС).

Фагочувствительность. Для фаготипирования V. cholerae С. Мукерджи предложил наборы бактериофагов, которые позволяют выделить среди V. cholerae 16 фаготипов. Холерный диагностический фаг ХДФ-3 избирательно лизирует холерные вибрионы классического типа, ХДФ-4 - вибрионы Эль-Тор, а ХДФ-5 лизирует вирулентные вибрионы обоих типов.

Резистентность. Холерный вибрион малоустойчив во внешней среде и плохо переносит инсоляцию и высушивание, но хорошо и долго сохраняется и даже размножается в открытых водоемах и сточных водах, богатых органическими веществами. В стоячих водоёмах возбудитель может сохраняться до 2-3 недель, в выгребных ямах - до 3-4 месяцев. Вибрион длительно сохраняется в продуктах с щелочным рН и высокой влажностью, а также на одежде и постельном белье, загрязнённых испражнениями больных. Все вибрионы очень чувствительны к действию дезинфектантов, особенно с кислым значением рН.

Холерные вибрионы в морской воде сохраняются до 47 суток, в речной воде

– от 3-5 дней до нескольких недель, в почве - от 8 дней до 3 месяцев, в свежих испражнениях - до 3 суток, на сырых овощах - 2-4 дня, на фруктах - 1-2 дня, в молоке и молочных продуктах - 5 дней. Холерные вибрионы при 80°С погибают через 5 минут, при 100°С - моментально.

Факторы патогенности:

1. Подвижность. Обладая подвижностью, вибрион преодолевает слизистый слой и вступает во взаимодействие с эпителиальными клетками кишечника.

7

2.Факторы адгезии и колонизации, с помощью которых вибрион прилипает

кмикроворсинкам и колонизирует слизистую оболочку тонкого кишечника. Адгезию вибрионов к клеткам слизистой оболочки обусловливают пили.

3.Ферменты муциназа, протеазы, нейраминидаза, лецитиназа способствуют адгезии и колонизации, так как разрушают вещества, входящие в состав слизи.

4.Экзотоксин холероген - главный фактор патогенности V. cholerae. Молекула холерогена имеет молекулярную массу 84 кД и состоит из двух фрагментов - А и В. Фрагмент В распознает рецептор энтероцита, связывается с ним и формирует внутримембранный канал для прохождения субъединицы А. Фрагмент А внутри клетки вызывает гидролиз АТФ с образованием цАМФ, в результате чего нарушается вводно-солевой обмен и отмечается гибель эпителия тонкой кишки.

5.Фактор, повышающий проницаемость капилляров.

6.Экзотоксины типа LТ, SТ и SLT.

7.Эндотоксин отвечает за общую интоксикацию организма и рвоту, угнетает фагоцитоз, снижает кровяное давление; вызывает инфекционно-токсические явления.

Патогенез. Попав в организм человека, значительная часть вибрионов погибает под действием кислой среды желудка, и лишь небольшая часть достигает тонкой кишки. Способность холерного вибриона быстро колонизировать эпителий кишечника обусловливают жгутики, муциназа (разжижает слизь и облегчает проникновение к поверхности эпителия) и нейраминидаза (обеспечивает взаимодействие с микроворсинками). После прикрепления к эпителиальным клеткам вибрионы теряют подвижность, интенсивно размножаются, колонизируя микроворсинки тонкого кишечника и одновременно вырабатывая большое количество экзотоксина-холерогена. Холероген проникает в клетки, где активируют аденилатциклазную систему, а накапливающийся цАМФ вызывает гиперсекрецию жидкости и солей из энтероцитов, что приводит к диарее и обезвоживанию организма.

Клинические проявления. Инкубационный период при холере варьирует от нескольких часов до 6 суток, чаще всего - 2-3 дня.

У большинства инфицированных лиц заболевание протекает бессимптомно, возможна лёгкая диарея. Заболевание проявляется общим недомоганием, болями в животе, рвотой и развитием выраженной диареи.

При тяжелой форме холеры у больных появляется понос, стул учащается, испражнения становятся обильными, принимают водянистый характер, утрачивают фекальный запах и имеют вид рисового отвара (мутная жидкость с плавающими в ней остатками слизи и клетками эпителия). Для холерной диареи характерно выделение значительного количества (до 10 л в сутки) водянистых бесцветных испражнений. В зависимости от степени интоксикации симптоматика может иметь характер гастроэнтерита или энтерита.

Затем присоединяется изнурительная рвота, сначала содержимым кишечника, а затем рвотные массы приобретают вид рисового отвара. Температура

убольного падает ниже нормы, кожа становится синюшной, морщинистой и холодной.

В результате обезвоживания происходит сгущение крови, развивается цианоз, кислородное голодание, резко страдает функция почек, появляются

8

судороги, больной теряет сознание и наступает смерть. Летальность от холеры во время седьмой пандемии в разных странах варьировала от 1,5% до 50%.

В тяжёлых случаях у больных резко снижается объём мочи с развитием острой почечной недостаточности. Характерна охриплость голоса или афония. Ведущие патогенетические факторы - гиповолемия и выраженные нарушения электролитного баланса, вследствие чего развиваются артериальная гипотензия, сердечная недостаточность, нарушение сознания и гипотермия. Подобное состояние определяют как холерный алгид. Характерный признак обезвоживания – “гиппократово лицо” (facies hippocratica): запавшие глаза, заострённые черты лица с резко выступающими скулами.

При отсутствии лечения летальность больных в алгидной стадии достигает 60%. Выздоровление сопровождается приобретением непродолжительной невосприимчивости. Нередко отмечают случаи повторного заражения.

Микробиологическая диагностика. Материал для исследований -

испражнения, рвотные массы, желчь, секционный материал, пищевые продукты. Материалом для исследования на вибриононосительство служат испражнения. Из объектов внешней среды чаще всего исследуют воду открытых водоемов и сточные воды.

При проведении исследований необходимо соблюдать следующие правила:

-материал следует доставлять в лабораторию не позже 2 часов после забора (так как возбудитель быстро погибает, особенно в испражнениях). При невозможности срочной доставки образцы помещают в транспортные среды (1% пептонная вода с рН 8,2-8,6);

-ёмкости для материала нельзя обеззараживать химическими веществами, так как возбудитель чувствителен даже к их следовым количествам. Все образцы помещают в герметически закрываемую транспортную тару;

-как можно быстрее произвести посев материала от больного (холерный вибрион сохраняется в испражнениях короткий срок);

-исключить возможность загрязнения и заражения окружающих объектов. Выделение культуры проводят по схеме:

-посев на пептонную воду (первую среду накопления) и на щелочной МПА;

-через 6 часов микроскопически исследуют пленку, образующуюся на пептонной воде, и проводят пересев на щелочной МПА;

-подозрительные колонии пересевают для получения чистой культуры, которую идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, подвижности и окончательно типируют с помощью диагностических агглютинирующих сывороток, а также с использованием холерных диагностических фагов.

Серологическая диагностика холеры имеет вспомогательный характер. С этой целью используют реакцию агглютинации, иммуноферментный или иммунофлюоресцентный методы.

Лечение больных холерой должно заключаться в восстановлении нормального водно-солевого обмена. С этой целью используют солевые растворы. Из антибактериальных препаратов применяют тетрациклиновые антибиотики, левомицетин, ко-тримоксазол.

9

Профилактика холеры включает организацию санитарно-гигиенических мероприятий, предупреждающих занос заболевания; проведение санитарнопросветительной работы среди населения; раннее выявление больных и носителей; массовое профилактическое назначение тетрациклинов в районах эпидемической опасности.

Для специфической иммунопрофилактики применяют убитые вакцины, холероген-анатоксин и энтеральная химическая бивалентная вакцина (включает анатоксин и О-антигены серотипов Инаба и Огава). Вакцинопрофилактику проводят по эпидемиологическим показаниям. В очагах холеры с профилактической целью назначают тетрациклин.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

1.Поставить реакцию агглютинации на стекле с неизвестной культурой и агглютинирующими дизентерийными сыворотками №1 и №2. При положительном результате реакции с сывороткой №1 провести реакцию агглютинации с использованием сыворотки Зонне.

2.Изучить демонстрационные ЭНТЕРО-тесты 1 и 2 для дифференциации кишечных бактерий.

7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки темы:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

10

3. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.