Занятие №16

ГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №16 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Характеристика семейства энтеробактерий. Эшерихии. Шигеллы.

2.Цели занятия: Изучить со студентами биологические свойства эшерихий и шигелл, факторы патогенности, патогенез, методы диагностики, профилактики и лечения вызываемых заболеваний.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение свойств эшерихий и шигелл.

3.2.Изучение патогенеза заболеваний, вызываемых эшерихиями и шигеллами.

3.3.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых эшерихиями и шигеллами.

3.4.Выполнение самостоятельной работы.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1.Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства эшерихий.

5.2.Факторы патогенности эшерихий и патогенез вызываемых заболеваний.

5.3.Методы диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых эшерихиями.

5.4.Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства шигелл.

5.5.Факторы патогенности шигелл и патогенез дизентерии.

5.6.Методы диагностики, профилактики и лечения дизентерии.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка I. Энтеробактерии:

1.Семейство Enterobacteriaceae.

2.Семейство Vibrionaceae – 2 рода (Vibrio, Aeromonas).

3.Семейство Pasteurellaceae - 3 рода (Haemophilus, Pasteurella, Actinobacillus).

3

Семейство Enterobacteriaceae включает более 20 родов, объединяющих около 100 видов бактерий. В число патогенных для человека входят рода

Escherichia, Shigella, Salmonella и другие.

Место обитания энтеробактерий - кишечник человека, животных и птиц, откуда они выделяются во внешнюю среду.

Энтеробактерии - грамотрицательные прямые или изогнутые палочки средних размеров. Спор не образуют. Факультативные анаэробы. Подвижные (перитрихиальное или полярное расположение жгутиков) или неподвижные формы.

Хорошо растут на простых питательных средах. Все представители семейства Enterobacteriaceae ферментируют углеводы до кислоты и газа или только до кислоты. Протеолитическая активность выражена слабо.

II. Эшерихии

Естественное место обитания эшерихий - кишечник человека, животных, птиц, пресмыкающихся, рыб, насекомых. Эти микроорганизмы были открыты в 1885 г. Теодором Эшерихом (выделены из фекалий ребенка, больного диареей – детской холерой).

Классификация. Род Escherichia включает в настоящее время 6 видов (E. coli, E. adecarboxylata, E. blattae, E. hermanii, E. vulneris, E. fergusonii). Основным видом является Escherichia coli.

Морфологические и тинкториальные свойства. Эшерихии - палочки средних размеров. Грамотрицательные, подвижные (перитрихи). Спор не образуют. Некоторые штаммы имеют микрокапсулу. В мазках под микроскопом располагаются беспорядочно, поодиночке.

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. Оптимальная температура для роста 35-37°С. Хорошо растут на простых питательных средах. На плотных средах образуют колонии средних размеров, гладкие, влажные, блестящие, с ровным краем. В жидких средах вызывают равномерное помутнение, иногда с осадком или пленкой.

Биохимические свойства. Эшерихии обладают высокой сахаролитической активностью – ферментируют углеводы (лактозу, глюкозу, маннит, арабинозу, галактозу) до кислоты и газа. Протеолитическая активность выражена слабо – желатин не разжижают, могут продуцировать индол. На среде Эндо (среда имеет бледно-розовый цвет) лактозоположительные штаммы образуют темно-красные колонии с металлическим блеском. Эшерихии, не ферментирующие лактозу, растут в виде серовато-белых (бесцветных) колоний.

На среде Плоскирева (среда коричневого цвета) лактозоположительные штаммы кишечной палочки образуют темно-красные колонии брусничного цвета.

На среде Левина (среда красно-фиолетового цвета) лактозоположительные штаммы кишечной палочки образуют темно-фиолетовые (черные) колонии с зеленым блеском.

Антигенная структура. Эшерихии имеют соматический О-антиген,

капсульный К-антиген и жгутиковый Н-антиген. О-антиген определяет серологическую группу. Имеется более 170 разновидностей О-антигена. Поверхностный К-антиген представлен 3 вариантами – А, В и L. Эти антигены отличаются друг от друга по термоустойчивости. А-антиген выдерживает кипячение

4

в течение двух часов. В-антиген выдерживает воздействие температуры 60°С в течение часа. L-антиген разрушается при нагревании до 60°С. У эшерихий обнаружено 100 разновидностей К-антигена, преимущественно В-типа. К-антиген располагается более поверхностно, чем О-антиген, поэтому он может препятствовать агглютинации О-сыворотками. В этом случае О-антиген можно выявить только после разрушения К-антигена кипячением в течение двух часов. Типовой специфичностью обладает Н-антиген, по которому эшерихии делятся на серологические варианты (более 50 сероваров).

Резистентность. В окружающей среде эшерихии достаточно устойчивы. При 60°С они погибают в течение 15 минут. В воде, почве сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев. Прямой солнечный свет вызывает гибель через несколько минут. Чувствительны к действию дезинфицирующих веществ.

Факторы патогенности:

1.Факторы адгезии и колонизации:

-фактор колонизации (фимбрии плазмидной природы);

-фактор адгезии (белок наружной мембраны, плазмидная природа).

2.Факторы инвазии (белки наружной мембраны, плазмидная природа).

3.Эндотоксины:

-цитотоксины термолабильные и термостабильные;

-Шига-подобный токсин;

-веротоксин.

Плазмиды E. coli: Col, R, Hly, Ent.

Роль в патологии. Выделяют следующие главные варианты E. coli:

1.Непатогенные (резидентные) кишечные палочки – комменсалы толстого кишечника;

2.Условно-патогенные кишечные палочки входят в состав нормальной микрофлоры кишечника, вызывают внекишечные поражения (цистит, сепсис) за счет эндогенного поступления эшерихий, колонизирующих кишечник, в другие ткани (мочевыводящие и желчные пути, легкие, брюшину, мозговые оболочки). Являются санитарно-показательными микроорганизмами (присутствие кишечной палочки в воде, почве, пищевых продуктах, на предметах обихода свидетельствует о их фекальном загрязнении);

3.Патогенные (диареегенные) эшерихии (транзиторные штаммы) вызывают острые кишечные инфекции (ОКИ), которые имеют экзогенное происхождение. Они подразделяются на 4 основные категории:

-энтеротоксигенные (ETEC, ЭТКП);

-энтероинвазивные (EIEC, ЭИКП);

-энтеропатогенные (EPEC, ЭПКП);

-энтерогеморрагические (EHEC, ЭГКП).

Энтеротоксигенные эшерихии:

-Поражают тонкий кишечник.

-Содержат фактор адгезии и колонизации (пили) белковой природы. Их синтез кодируется плазмидами. Благодаря наличию пилей энтеротоксигенные эшерихии размножаются на поверхности эпителия тонкой кишки.

5

-Продуцируют термолабильный (LT) и термостабильный (ST) энтеротоксины.

-Вызывают развитие диарейного синдрома - холероподобного заболевания (диареи путешественников). Заражающая доза – 108-1010 клеток. Токсин вызывает активацию циклического АМФ в энтероцитах, после чего резко повышается проницаемость сосудистых стенок и эпителия кишечника. Жидкая часть крови устремляется в просвет кишечника, что приводит к потере электролитов, белков. Клинически наблюдается водянистая профузная диарея, тошнота, рвота, кишечные спазмы, лихорадка, резкое обезвоживание. В испражнениях обнаруживается небольшое количество слизи.

-Вспышки водные, реже - пищевые.

-Сезонность летняя.

-Болеют дети в возрасте от 1 года до 3 лет и взрослые.

-Включают 17 серогрупп (О6, О8, О15, О20, О25, О27, О63, О78, О80, О85, О115, О128ас, О139, О148, О153, О159, О167).

Энтероинвазивные эшерихии:

-Внедряются и размножаются в клетках эпителия нижнего отдела подвздошной и толстой кишки (внутриклеточное паразитирование). Это свойство обусловлено наличием плазмиды размером 140 мДа.

-Вызывают дизентериеподобное заболевание (непродолжительная

водянистая диарея, лихорадка, токсикоз). В стуле возможна примесь крови, слизи, лейкоцитов. Заражающая доза – 105 клеток.

-Болеют дети в возрасте от 1,5 до 2 лет, но могут болеть подростки и взрослые.

-Сезонность летне-осенняя.

-Вспышки пищевые, водные.

-Включают 9 серогрупп (О28ас, О29, О124, О136, О143, О144, О152, О164,

О167).

Энтеропатогенные эшерихии:

-Содержат белок наружной мембраны (интимин) и пили.

-Продуцируют сильный эндотоксин.

-Эти бактерии прикрепляются к клеткам эпителия, разрушают

микроворсинки и образуют эрозии. Они колонизируют поверхность слизистой оболочки нижнего отдела тонкой кишки. Заражающая доза 105 - 1011 клеток. Часто внедряются в лимфатические сосуды и попадают в кровь.

-Клинически - продолжительная водянистая диарея, рвота, лихорадка, симптомы обезвоживания (колиэнтерит). В стуле обнаруживается примесь слизи.

-Контактно-бытовой путь.

-Болеют дети в возрасте до двух лет.

-Сезонность не выражена.

-Вспышки бытовые, редко пищевые.

-Включают 13 серогрупп (О18, О44, О55, О86, О111, О112, О114, О119, О125, О126, О127, О128 аb, О142).

Энтерогеморрагические эшерихии:

-Адгезия на поверхности эпителия с помощью белка (интимина) и пилей.

-Синтез шига-подобных токсинов (SLT-I или SLT-II).

6

-Поражаются слепая, восходящая и поперечная толстая кишка. Разрушение эндотелия мелких кровеносных сосудов, нарушение кровотока, ишемия и некроз клеточной стенки.

-Клинически - колитический синдром, отсутствием лихорадки. Кал с кровью. Около 5% больных погибает, у 12-30% возникают тяжелые осложнения, включая почечную недостаточность, поражение центральной нервной системы.

-Тип вспышек – пищевой.

-Источник инфекции – крупный рогатый скот и овцы.

-Основной путь передачи – алиментарный.

-Сезонность летне-осенняя.

-Поражаются все возрастные группы.

-Включает 4 серогруппы (О26, О111, О145, О157).

Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется ненапряженный, типоспецифический иммунитет.

Лабораторная диагностика. Исследуемый материал – фекалии, гнойное отделяемое раны, моча, кровь. Методы диагностики:

-бактериоскопический;

-бактериологический. Посев материала на среду Эндо;

-серологический: реакция агглютинации на стекле с поливалентными сыворотками и материалом из колоний.

Чистую культуру выделяют из колоний, давших положительную реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой.

Идентификацию выделенных культур проводят путем изучения ферментативной активности и антигенной структуры. Определяют серологическую группу с живой и прогретой культурой с помощью О- и К-сывороток. Для выявления О-антигена культуру эшерихий кипятят на водяной бане в течение 1-2 часов, что приводит к разрушению К-антигена.

Схема микробиологической диагностики эшерихиозов:

1 день – посев на среды Эндо, Плоскирева. 2 день:

-РА с поливалентной сывороткой (для характерных колоний) на стекле;

-пересев на скошенный агар и агар Клиглера.

3 день:

-РА с поливалентной сывороткой (для характерных колоний) на стекле;

-пересев на среды (на индол, среду Сименса, среду с мочевиной, среду с лизином, среды Гисса, среду Кларка);

4 день:

-РА с поливалентными ОК-сыворотками, групповыми ОК-сыворотками и факторными О-сыворотками;

-линейная РА, определение Н-антигенов методом иммобилизации в агаре;

5 день – учет результатов РА.

Профилактика. Специфическая профилактика не разработана. Основу неспецифической профилактики составляют санитарно-гигиенические и противоэпидемические мероприятия.

7

III. Шигеллы

Историческая справка. Возбудитель бактериальной дизентерии был впервые описан в 1888 году А. Шантемессом и Ф. Видалем. В 1891 г. возбудитель был описан русским армейским врачом А.В. Григорьевым, а в 1898 г. японский бактериолог Киёси Шига с помощью сыворотки, полученной от больного, идентифицировал возбудителя у 34 больных дизентерией, окончательно доказав этиологическую роль этой бактерии (палочка Григорьева – Шига). Род получил название в честь К. Шига. Ученые Д.С. Бойд, А. Флекснер, К. Зонне выделили и описали микроорганизмы, различающиеся по некоторым свойствам. Каждый из таких вариантов получал название в честь первооткрывателей (S. boydii, S. flexneri, S. sonnei).

Морфологические и тинкториальные свойства. Шигеллы - короткие неподвижные грамотрицательные палочки. Не образуют капсул и спор. При микроскопии мазков шигеллы располагаются беспорядочно.

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. Растут в широком диапазоне температур (от 10 до 45°С), оптимальная температура - 37°С, оптимальная рН 6,7-7,2. К питательным средам не требовательны. На плотных средах образуют мелкие (диаметром около 2 мм) гладкие, с ровными краями, выпуклые, блестящие, полупрозрачные колонии. На плотных дифференциальнодиагностических средах с лактозой (Плоскирева, Эндо, Левина) колонии бесцветные (серовато-белые). В жидких средах вызывают равномерное помутнение.

Биохимическая активность. Углеводы ферментируют до кислоты. Не ферментируют лактозу (за исключением Sh. sonnei, которая способна ферментировать лактозу замедленно, в течение 48-120 часов). Не продуцируют сероводород, не разжижают желатин. Могут образовывать индол.

Антигенная структура. Содержат соматический О- и капсульные К- антигены. В зависимости от особенностей строения О-антигена делятся на 4 серогруппы. Внутри серогрупп выделяют серотипы или серовары: серогруппа А – Sh. dysenteriae (16 серотипов); серогруппа В – Sh. flexneri (5 серотипов и 2 варианта); серогруппа С – Sh. boydii (18 серотипов); подгруппа D – Sh. Sonnei (серотипов не выделяют).

Факторы патогенности:

-факторы адгезии и колонизации (пили, белки наружной мембраны, липополисахарид клеточной стенки);

-ферменты агрессии, разрушающие слизь (нейраминидаза, гиалуронидаза, муциназа);

-экзотоксины (токсин Шига и шига-подобные токсины), нарушающие синтез белка;

-эндотоксин шигелл подавляет активность клеток иммунной памяти.

Все виды шигелл обладают способностью к размножению в клетках эпителия слизистой оболочки толстой кишки и межклеточному распространению. Эта способность определяется наличием плазмиды, которая имеется у всех четырех видов шигелл.

Резистентность. Во влажной почве сохраняют жизнеспособность до трех месяцев, в воде – в течение 92 дней, в молоке – до скисания, в масле – в течение 8-10 дней. Sh. sonnei в молоке и молочных продуктах способны размножаться. Шигеллы

8

хорошо переносят высушивание, низкие температуры (во льду сохраняются до 96 дней), но быстро погибают при действии прямого солнечного света, нагревании (при 60°С в течение 30 минут, при 100°С – моментально). Чувствительны к дезинфицирующим веществам и антибиотикам (тетрациклину, стрептомицину); из химиопрепаратов чувствительны к нитрофуранам и сульфаниламидам.

Эпидемиология. Источником инфекции - человек, больной острой или хронической дизентерией, либо бактерионоситель. Механизм передачи - фекально-

оральный. Пути передачи возбудителя:

-алиментарный (преобладающий путь для шигелл Зоне);

-водный (преобладающий для шигелл Флекснера);

-контактно-бытовой (является ведущим для S. dysenteriaе).

Естественная восприимчивость людей к дизентерии высокая. Дизентерия распространена повсеместно. Обычно заболевания возникают в виде вспышек алиментарного или водного характера. Чаще болеют дети до 10-летнего возраста. Характерна летне-осенняя сезонность. Инфицирующая доза около 180 микробных клеток (10-109 клеток).

Патогенез. Возбудитель попадает с инфицированными продуктами в желудок, где под влиянием желудочного сока часть микробов распадается с выделением эндотоксина, который всасывается в кровь. Это может обусловить кратковременную пирогенную реакцию и преходящие симптомы интоксикации. Основное место локализации возбудителя - нисходящий отдел толстого кишечника (сигмовидная и прямая кишка).

Формирование инфекционного очага в слизистой оболочке кишечника носит циклический характер: адгезия, колонизация, внедрение шигелл в цитоплазму энтероцитов, их внутриклеточное размножение, разрушение и отторжение эпителиальных клеток, выход возбудителей в просвет кишечника; вслед за этим начинается очередной цикл - адгезия, колонизация и т. д.

Сам возбудитель в кровь не попадают. Эндотоксин разрушенных бактерий вызывает интоксикацию, усиление перистальтики кишечника, понос, схваткообразные боли по ходу толстого кишечника, ложные позывы на дефекацию.

Клиника. Дизентерия (dysenteria) – острое инфекционное заболевание, которое клинически проявляется частым болезненным стулом с испражнениями с примесью крови и слизи и интоксикацией. Инкубационный период - от нескольких часов до 3-7 дней. Постепенно или сразу развиваются явления острого колита. Характерны резкие, коликообразные боли в животе и частые, ложные, мучительные позывы к дефекации – тенезмы (до 20-30 раз в сутки). Испражнения становятся слизисто-водянистыми, с примесью слизи и гноя, а при более тяжелом течении дизентерии – крови, гноя и частиц слизистой кишечника. Заболевание продолжается 1-3 недели. Первоначально стул частый со слизью и кровью (гноем), затем – “ректальный плевок” – отделение последней порции.

Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется антимикробный и антитоксический иммунитет. Иммунитет вариантоспецифический, возможны повторные заболевания.

Лабораторная диагностика. Исследуемый материал - испражнения, которые засевают на дифференциально-диагностические питательные среды с лактозой (Плоскирева, Эндо, Левина). Для выделения чистой культуры отбирают

9

лактозонегативные (бесцветные) колонии, которые пересевают на трехсахарный агар (среда Олькеницкого). Для определения вида изучают биохимические свойства. Антигенную структуру изучают с моно- и поливалентной сыворотками.

В качестве вспомогательного используют РНГА.

Схема диагностики шигеллеза:

1день - посев на среды Эндо, Плоскирева, Левина, жидкую селенитовую среду (среда обогащения);

2день – посев на индол, агар Клиглера, среду с мочевиной по Преусу, цитратный агар Сименса, среду Кларка;

3день – посев на среды с лизином, цитратный агар, среды Гисса с маннитом, ксилозой, рамнозой, мальтозой;

4день – РА с поливалентными и моновалентными сыворотками.

Лечение. Антибиотики применяют после определения антибиотикограммы. Наиболее эффективными являются фторхинолоны. Для лечения может применяться дизентерийный бактериофаг. Фаг может использоваться и для экстренной профилактики. В случае возникновения дисбактериоза показано применение препаратов для коррекции микрофлоры.

Профилактика неспецифическая - комплекс санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

1.Студенты готовят препараты из чистых культур кишечной палочки со скошенного агара, окрашивают их по Граму, микроскопируют, зарисовывают в рабочую тетрадь.

2.В рабочей тетради студенты записывают схемы лабораторной диагностики эшерихиозов и дизентерии.

7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки темы:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65

10

“Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.