Занятие №14

ГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №14 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Гноеродные кокки. Стафилококки. Стрептококки. Характеристика. Роль в патологии. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых стафилококками и стрептококками. Профилактика.

2.Цели занятия: Изучить со студентами свойства стафилококков и стрептококков, их роль в патологии человека, методы диагностики, профилактики и лечения вызываемых заболеваний.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение свойств стафилококков и стрептококков.

3.2.Изучение патогенеза и клинической картины заболеваний, вызываемых стафилококками и стрептококками.

3.3.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых стафилококками и стрептококками.

3.4.Выполнение самостоятельной работы.

3

I. Патогенные кокки (греч. coccos - зерно) относятся к типу Firmicutes,

семействам Staphylococcacecae и Streptococcaceae.

Кокки широко распространены в природе. Они обитают на слизистых и кожных покровах, во внешней среде, устойчивы к неблагоприятным факторам и чувствительны к анилиновым красителям. Некоторые из них, особенно стафилококки, являются условно-патогенными микроорганизмами.

Биологические особенности патогенных кокков:

-кокки различных видов вызывают аналогичные инфекционные процессы, сопровождающиеся нагноением;

-кокки одного вида часто являются причиной различных инфекционных процессов: от местного воспаления до множественных абсцессов и сепсиса;

-у некоторых видов кокков выражена органотропность (диплококки чаще других видов вызывают пневмонию; менингококки - воспаление оболочек спинного

иголовного мозга);

-кокки нередко служат причиной пищевых токсикоинфекций;

-все патогенные кокки в большей или меньшей степени продуцируют

токсины.

Патогенные кокки вызывают карбункулы, фурункулы, абсцессы, артриты, эндометриты и другие гнойно-воспалительные поражения, поэтому часто называются пиогенными (гноеродными) кокками.

Патогенные кокки часто участвуют в проявлении ассоциативных инфекций, вызванных E. coli, клостридиями, Proteus vulgaris.

Морфологические свойства. Кокки - грамположительные (за исключением менингококков и гонококков) бактерии шаровидной формы. Спор не образуют. Неподвижные. Размер кокков - от 0,2-0,4 до 4,0-4,5 мкм.

Культивирование. Для выращивания кокков используют среды с кровью (плазмой крови), асцитической жидкостью, глюкозой. Кокки являются аэробами или факультативными анаэробами, растут при температуре 35-40°С и рН 7,0-7,5.

Большинство кокков отличается высокой биохимической активностью по отношению к сахарам и белкам.

Антигенная структура. У стафилококков антигенностью обладает клеточная стенка, содержащая пептидогликан, тейхоевые кислоты и белок А.

По антигенной структуре все стрептококки подразделяются на 17 серологических групп. В основу антигенной классификации стрептококков положены свойства полисахарида (С-вещество) клеточной стенки и белковые антигены (группы А).

Токсигенность. Патогенные кокки продуцируют альфа-, бета-, гамма-, дельта-гемолизины (вызывают гемолиз эритроцитов), лейкоцидин (вызывает дегрануляцию и разрушение лейкоцитов и угнетает их фагоцитарные свойства) энтеротоксины (вызывают пищевые токсикозы), ферменты патогенности (гиалуронидазу, фибринолизин, дезоксикарбоксилазу).

Патогенные кокки вызывают заболевания чаще всего в ослабленном организме и при иммунодефицитных состояниях. Кокки проникают в организм через поврежденную кожу, слизистые оболочки, алиментарно.

4

II. Стафилококки (греч. staphyle - виноградная гроздь, kokkos - зерно, ягода) - сферические грамположительные неподвижные аспорогенные бактерии рода Staphylococcus из семейства Staphylococcaceae. Открыты в 1878 г. Р. Кохом, а в 1880 г. независимо друг от друга Л. Пастером из гноя фурункула человека и А. Огстоном. Более детально изучены Ф. Розенбахом в 1884 г.

В 1976 г. Международным комитетом по таксономии стафилококков официально утверждены следующие три вида стафилококков:

1.S. aureus – золотистый стафилококк, патогенный. Он колонизируют слизистые оболочки носовой полости, носоглотки и кожные покровы.

2.S. epidermidis - условно-патогенный, является постоянным обитателем кожи и слизистых оболочек. Чаще всего вызывает заболевания у человека при использовании всевозможных протезов, катетеров, дренажей.

3.S. saprophyticus - непатогенный стафилококк, колонизирует кожные покровы половых органов и слизистую оболочку мочеиспускательного канала.

Морфология. Стафилококки - сферические клетки диаметром 0,5-1,5 мкм. В препаратах из гноя и молодых бульонных культур располагаются одиночно, парами или небольшими группами; в мазках из агаровых культур - в виде отдельных скоплений неправильной формы, напоминающих гроздь винограда. Жгутиков и капсул не имеют; споры не образуют. Грамположительные.

Культивирование. Аэробы или факультативные анаэробы. Хорошо растут на универсальных питательных средах при 35-40°С, оптимум рН 7,0-7,5. Добавление к питательной среде глюкозы или крови ускоряет рост стафилококков. Характерное свойство большинства штаммов - способность расти в присутствии 10% хлорида натрия и 40% желчи.

На МПА образуют круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара колонии с ровными краями диаметром 2-3 мм. Колонии могут быть окрашены в золотисто-желтый, лимонно-желтый или белый цвет, так как стафилококки вырабатывают нерастворимые в воде пигменты. Наиболее интенсивно пигменты образуются при росте на агаре с 10% обезжиренного молока после 24-часовой инкубации при 37°С и на картофеле при 20-25°С в аэробных условиях на свету. S. aureus синтезирует золотистый или оранжевый пигмент, встречаются и беспигментные штаммы; у большинства штаммов S. saprophyticus пигментообразование отсутствует.

Рост в МПБ сопровождается диффузным помутнением с последующим выпадением рыхлого хлопьевидного осадка. В столбике желатина при посеве уколом через 36-48 часов наряду с обильным ростом по линии укола намечается начальное разжижение среды, которое затем увеличивается, и к 4-5 суткам образуется воронка, наполненная жидкостью. На кровяном агаре патогенные штаммы стафилококков образуют значительную зону гемолиза эритроцитов.

Биохимические свойства. Стафилококки ферментируют с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, фруктозу, сахарозу, ксилозу, глицерин, манит и не разлагают дульцит, салицин, инулин, раффинозу. Выделяют аммиак и сероводород, не образуют индол, восстанавливают нитраты в нитриты; продуцируют каталазу, фосфатазу, уреазу, а патогенные штаммы - аргиназу. Свертывают и пептонизируют молоко, разжижают желатин (разжижение среды в форме воронки), иногда свернутую сыворотку крови. Каталазоположительные.

5

Факторы патогенности. Патогенные стафилококки синтезируют и секретируют высокоактивные экзотоксины и ферменты патогенности.

А. Экзотоксины.

1. Мембранотоксины (гемолизины, гемотоксины, стафилолизины).

К гемотоксинам относятся альфа-, бета-, гамма- и дельта-гемолизины. Вызывают лизис эритроцитов.

2.Лейкоцидин - вызывает дегрануляцию и разрушение лейкоцитов.

3.Энтеротоксины - термостабильные полипептиды, образуются при размножении энтеротоксигенных штаммов стафилококков в питательных средах, продуктах питания (молоко, сливки, творог и др.), кишечнике. Устойчивы к действию пищеварительных ферментов.

4.Гистотоксин - летальный и дермонекротический.

Б. Ферменты патогенности.

1.Коагулаза (коагуляция плазмы крови).

2.Гиалуронидаза (разрушает гиалуроновую кислоту, способствует проникновению микробов в ткани).

3.Фибринолизин (растворяет фибрин).

4.ДНК-аза (разрушает ДНК).

5.Лецитиназа (разрушает фосфолипиды).

Наибольшую роль в патогенности стафилококков играет коагулаза - бактериальная протеаза, свертывающая плазму крови. Наличие коагулазы служит одним из наиболее важных и постоянных критериев патогенности стафилококков.

Антигенная структура. В настоящее время у стафилококков выделяют более 50 антигенных субстанций, разделяемых на родовые, видовые и типовые антигены. Родовые антигены способны перекрестно реагировать с изоантигенами клеток организма человека, что может приводить к развитию аутоиммунной патологии.

Пептидогликан - общий видовой для стафилококков антиген.

Тейхоевые кислоты - видоспецифические полисахаридные антигены. S. aureus содержит рибитолтейхоевую кислоту (полисахарид А), S. epidermidis - глицеринтейхоевую кислоту, называемую полисахаридом В. Тейхоевые кислоты активируют систему комплемента по альтернативному пути, свертывающую и калликреин-кининовую системы, а также облегчает адгезию бактерий к эпителиальным клеткам. Тейхоевые кислоты способны ингибировать поглотительную активность фагоцитов.

Протеин А (агглютиноген А) обнаружен у золотистого стафилококка; представляет собой низкомолекулярный белок, имеющий свойство соединяться с Fc-фрагментами IgG, что активирует систему комплемента по классическому и альтернативному путям и усиливает активность естественных киллеров. Штаммы, продуцирующие большое количество белка А, обладают более высокой резистентностью к фагоцитозу.

Устойчивость. Стафилококки относительно резистентные микроорганизмы. Прямые солнечные лучи убивают их только через несколько часов. В пыли они сохраняются 50-100 суток, в высушенном гное - более 200 суток, в бульонной культуре - 3-4 месяца, на полужидком агаре - 6 месяцев. В жидкой среде при 70°С

6

погибают через 1 час, при 85°С - через 30 минут, при 100°С - за несколько секунд. Из дезинфектантов 1% раствор формалина и 2% раствор гидроксида натрия убивают их в течение 1 часа, 1% раствор хлорамина - через 2-5 минут. Стафилококки обладают высокой чувствительностью к бриллиантовому зеленому и кристаллвиолету, что позволяет использовать эти красители при стафилококковых поражениях кожи.

Многие штаммы чувствительны к антибиотикам - бензилпенициллину, полусинтетическим пенициллинам, стрептомицину, левомицетину, тетрациклину, фузидину, а также нитрофурановым препаратам. Однако часто встречаются и резистентные к антибиотикам штаммы. Они, как правило, характеризуются множественной лекарственной устойчивостью, которая контролируется R- плазмидами.

Патогенез. В организм стафилококки проникают через поврежденную кожу и слизистые оболочки, энтеротоксины - с пищей.

Стафилококковые инфекции чаще развиваются и тяжелее протекают в условиях снижения естественной резистентности организма и при иммунодефицитных состояниях, аллергии.

Клинические проявления. Инфекции, вызываемые S. aureus, включают более 100 нозологических форм (кожные гнойничковые инфекции, эндокардиты, артриты, пневмонии, инфекции мочевыводящей системы и др.). Особое место занимают поражения, вызванные действием токсинов – синдром “ошпаренного младенца”, синдром “ошпаренной кожи”, синдром токсического шока, пищевые отравления.

Лабораторная диагностика. Исследуют раневой экссудат, гной абсцессов, ран, кровь. При необходимости исследуют пробы пищи.

Предварительный диагноз можно поставить при микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

Окончательный диагноз устанавливается на основании выделения возбудителя следующими методами:

-посев на ЖСА, МПА, КА;

-посев на дифференциально-диагностические среды – КА, ЖСА, молочно-

солевой агар (МСА), молочно-желточно-солевой агар;

-коагулазный тест;

-серологическое исследование (ИФА или РПГА);

-идентификация с помощью типовых бактериофагов;

-биологическая проба на котятах для обнаружения энтеротоксинов;

-определение чувствительности к антибиотикам.

Патогенные штаммы на кровяном агаре образуют вокруг колоний зону гемолиза.

На чашках с молочно-солевым и на обычном МПА отмечается образование пигмента.

На желточно-солевом агаре большинство патогенных стафилококков вызывает реакцию на лецитиназу, которая проявляется образованием вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.

Для выделения чистой культуры из подозрительной колонии производят пересев на МПА. В качестве селективной среды для выделения стафилококков

7

используют МПА, содержащий 8-10% хлорида натрия и 5% дефибринированной крови.

Для полной характеристики патогенных штаммов определяют способность ферментировать манит, коагулировать плазму крови, выделять фибринолизин, лецитиназу, ДНКазу, обладать потенциальной гемолитической активностью, выделять дермонекротоксин, токсин общего действия и энтеротоксин, а также проводят фаготипирование.

В связи с широким распространением штаммов стафилококков, резистентных к лекарственным препаратам, проводят определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам на плотной среде методом бумажных дисков.

Иммунитет. Здоровые люди обладают естественной резистентностью к стафилококковой инфекции. Она обусловлена барьерной функцией кожи и слизистых оболочек, фагоцитозом и наличием специфических антител, образуемых в результате естественной иммунизации. Распространению микробов в организме также препятствует воспалительная реакция в месте внедрения возбудителя.

Биопрепараты. Для профилактики и лечения стафилококковых инфекций разработаны и применяются аутовакцина (прогретый при 70-75°С смыв агаровой культуры стафилококка, выделенного из организма больного), стафилококковый иммуноглобулин, антистафилококковую донорскую гипериммунную плазму. Иногда местно применяют бактериофаг и фильтрат 2-3-недельной бульонной культуры стафилококка.

III. Стрептококки (Streptococcus) - бактерии, относящиеся к семейству

Streptococcaceae, роду Streptococcus. Род Streptococcus включает 21 вид. Впервые стрептококки выделил из тканей людей, больных рожей, и при раневых инфекциях в 1874 г. Т. Бильрот, а описали при септицемии и гнойных поражениях Л. Пастер в 1879 г. и А. Огстон в 1881 г. Чистую культуру стрептококков выделили и изучили Ф. Фелейзен (1883) и А. Розенбах (1884).

Морфология. Размеры стрептококков 0,5-2,0 мкм. В мазках они располагаются парами или короткими цепочками, особенно при выращивании в жидких питательных средах, что и послужило основанием для их названия (греч. streptos - цепочка, kokkos - ягода). Клеточная стенка стрептококков содержит тейхоевые кислоты, углеводы и пептидогликаны, на ее поверхности расположены фимбрии, а у патогенных видов имеется капсула.

У человека стрептококки заселяют слизистые оболочки, кожу и проявляют свою патогенность при снижении общей резистентности организма или отдельных его тканей (травма, ожог и др.), вызывая пневмонии, отиты, менингиты и другие заболевания. Иногда стрептококки осложняют вирусные и бактериальные инфекции.

По классификации Берджи стрептококки подразделяются на 3 группы:

1.Гноеродные гемолитические стрептококки. К ним относится S. pyogenes (возбудители различных гнойно-воспалительных процессов - абсцессов, флегмон, сепсиса).

2.Зеленящие стрептококки - S. viridans (термофильные, фекальные).

8

3.Молочнокислые стрептококки – S. lactis (молочный стрептококк), S. cremoris (сливочный стрептококк).

По гемолитическим свойствам различают альфа-гемолитические стрептококки (неполный или частичный гемолиз, зеленая окраска среды), бетагемолитические стрептококки (полный гемолиз), негемолитические стрептококки (гамма-стрептококки, не дающие видимого гемолиза).

По происхождению и значению выделяют следующие виды стрептококков:

-пиогенные стрептококки - возбудители гнойных инфекций и сепсиса;

-лактис-стрептококки - кислотообразующие стрептококки, встречающиеся в молоке и используемые при изготовлении ферментированных молочных продуктов;

-энтерококки - первично встречающиеся в кишечнике, вне кишечника являются причиной воспалительных процессов.

Антигенная структура. Все стрептококки подразделяют на 17 серологических групп, обозначаемых латинскими буквами. Группа А - возбудители большого числа инфекций у человека, В - возбудители мастита у коров; группы В, С, D, Е - возбудители инфекций у животных разных видов. Антиген, позволяющий определить серогруппу, представляет собой полисахарид (С-вещество) клеточной стенки.

Факторы патогенности стрептококков.

1.Экзотоксины:

-гемолизины - обусловливают разрушение эритроцитов; являются антигенами, вызывают образование нейтрализующих антител;

-лейкоцидин - разрушает лейкоциты, угнетает их фагоцитарные свойства;

-летальный токсин (некротоксин) - при внутрикожном введении кролику вызывает некроз кожи и других тканей.

Экзотоксины отличаются термолабильностью: гемолизин инактивируется при 55°С в течение 30 минут, лейкоцидин - при 70°С.

2.Ферменты стрептококков:

-гиалуронидаза;

-фибринолизин;

-дезоксирибонуклеаза (стрептодорназа);

-рибонуклеаза;

-нейраминидаза;

-протеаза;

-стрептокиназа;

-амилаза;

-липаза.

Иммунитет. Врожденный иммунитет против стрептококков выражен слабо (кроме скарлатины у человека), характеризуется слабой напряженностью и непродолжительностью.

Клинические проявления. Проявлениями стрептококковой инфекции являются фарингиты, скарлатина, кожные инфекции, синдром токсического шока, острая ревматическая лихорадка, острый гломерулонефрит, пневмония, менингит, эндокардиты и др.

9

Стрептококки группы А. Стрептококки группы А имеют некоторые особенности структуры клеточной стенки, отличающие их от других стрептококков. Клеточная стенка стрептококки группы А включает следующие структуры:

-капсула (защищает бактерии от фагоцитов и облегчает адгезию к эпителию);

-фимбрии (являются основными адгезинами);

-группоспецифические углеводные антигены;

-белок М - основной фактор вирулентности стрептококков группы А. Белок

Мингибирует фагоцитоз путем адсорбции на своей поверхности фибриногена и фибрина;

-тейхоевые кислоты;

-пептидогликан;

-цитоплазматическая мембрана.

Большинство изолятов стрептококков группы А принадлежит к виду S. pyogenes, поэтому оба названия встречаются часто как синонимы. Они обнаруживаются повсеместно, часто колонизируют кожные покровы и слизистые оболочки. Вызывают воспалительные заболевания (фарингиты, послеродовые инфекции, эндокардиты, менингиты, артриты, пневмонии, отиты, гломерулонефриты).

Кфакторам патогенности стрептококков группы А относятся:

-белок М;

-капсула;

-с5а-пептидаза (подавляет активность фагоцитоза за счет расщепления и инактивации С5а компонента комплемента);

-стрептолизин О (разрушает эритроциты в анаэробных условиях и повреждает кардиомиоциты);

-стрептолизин S (разрушает эритроциты и фагоциты, поглотившие бактерии);

-эритрогенные (пирогенные) токсины (митогенное действие на Т-клетки, стимуляция секреции макрофагами ИЛ-1 и ФНО);

-кардиогепатический токсин (поражает миокард, образует гигантоклеточные гранулемы в печени);

-стрептокиназа или фибринолизин;

-гиалуронидаза;

-стрептодорназа или ДНКаза;

-НАДаза.

Микробиологическая диагностика стрептококков группы А включает в себя следующие методы:

-посев на кровяной агар (блестящие вязкие колонии с зоной гемолиза);

-определение чувствительности к антимикробным агентам методом дисков;

-определение ПИР-теста (стрептококки группы А дают положительную реакцию расщепления пирролидонил-β-нафтиламида).

Стрептококки группы В. Стрептококки группы В обычно колонизируют носоглотку, ЖКТ и влагалище человека. Подавляющая часть изолятов - S. agalactiae. Серологически стрептококки группы В подразделяются на серовары 1а, 1b, 1с, II и III.

10

Основные факторы патогенности стрептококков группы В - капсула и нейраминидаза.

Вызывают пневмонии, менингиты у детей, послеродовые инфекции у женщин, эндокардит.

Микробиологическая диагностика стрептококков группы В включает в себя определение чувствительности к бацитрацину и триметоприм-сульфаметоксазолу, постановку теста гидролиза гиппурата и САМР-теста (тест выявления скрытого гемолиза).

IV. Пневмококки. Открыты в 1871 г. Л. Пастером. Являются постоянными обитателями слизистых оболочек респираторного тракта, пищеварительного аппарата. Пневмококки не содержат группового антигена и серологически по антигенам капсульных полисахаридов подразделяются на 84 серовара. Являются возбудителем пневмоний.

Размеры пневмококков 0,8-1,25 мкм. Неподвижные. Спор не образуют. Капсулообразование наблюдается преимущественно в организме человека.

В мазках из клинического материала пневмококк располагается парами (диплококки), каждая пара окружена толстой капсулой. Хорошо растет на сывороточном и кровяном агаре. На КА образует зону гемолиза зеленоватого цвета. На МПА образует прозрачные мелкие гладкие круглые колонии с ровными краями. В МПБ образует равномерное помутнение с небольшим осадком. Свертывает молоко. Желатин не разжижает.

Ферментирует левулезу, маннозу, глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, ксилозу, инулин и манит; не ферментирует декстрозу, раффинозу, арабинозу и дульцит.

Факультативный аэроб.

Во внешней среде пневмококки погибают в течение 3-4 недель. Нагревание до 85°С выдерживают в течение 30 минут. За 1-2 минуты гибнут от воздействия 1% раствора формалина, 2% раствора едкого натра, 10% взвеси свежегашеной хлорной извести.

Факторами патогенности пневмококка являются капсула и субстанция С (тейхоевая кислота клеточной стенки, содержащая холин, специфически взаимодействующий с С-реактивным белком).

Микробиологическая диагностика пневмококка основана на использовании теста чувствительности к оптохину (это вещество угнетает 100% пневмококка), способности ферментировать инулин, а также чувствительности к солям желчных кислот (дезоксихолатной пробы - лизис пневмококков в присутствии желчных кислот).

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

1. Студенты готовят препараты из чистых культур стафилококков и стрептококков со скошенного агара, окрашивают их по Граму, микроскопируют, зарисовывают в рабочую тетрадь.