Занятие №21

ГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №21 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Возбудитель туберкулеза

2.Цели занятия: Изучить со студентами свойства возбудителя туберкулеза, факторы патогенности возбудителя, патогенез, методы диагностики, профилактики и лечения туберкулеза.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение свойств возбудителя туберкулеза.

3.2.Изучение патогенеза туберкулеза.

3.3.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения туберкулеза.

3.4.Выполнение самостоятельной работы.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1.Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства возбудителей туберкулеза.

5.2.Факторы патогенности возбудителей туберкулеза.

5.3.Методы диагностики, профилактики и лечения туберкулеза.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка

Туберкулез (лат. tuberculum - бугорок) – хроническое инфекционное заболевание, сопровождающееся специфическим поражением различных органов и систем (органов дыхания, лимфатических узлов, кишечника, костей, суставов, глаз, кожи, почек, мочевыводящих путей, половых органов, ЦНС). При туберкулезе в органах образуются специфические гранулемы (granulum – зернышко) в виде узелков или бугорков (tuberculum – бугорок) с последующим их творожистым перерождением (распадом) и обызвествлением.

Историческая справка. С глубокой древности это заболевание было известно под названиями чахотка, бугорчатка, золотуха из-за характерных клинических признаков. Впервые отделил “чахотку” от других легочных заболеваний Лаэннек в 1819 г., он ввел термин “туберкулез” (отсюда синоним - бугорчатка). В 1882 г. Р. Кох обнаружил возбудителя туберкулеза и получил чистую культуру на сывороточной среде (палочка или бацилла Коха). В 1890 г. Р. Кох

3

получил туберкулин. В 1911 г. Р. Кох за открытие возбудителя туберкулеза был удостоен Нобелевской премии.

Таксономия. Отдел Firmicutes, семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium (греч. myces - гриб и bacteria - палочка).

Все микобактерии по патогенности распределяются на 3 группы:

-патогенные микобактерии (возбудители туберкулеза и лепры, или

проказы);

-потенциально патогенные (условно-патогенные, нетуберкулезные, атипичные) микобактерии (возбудители микобактериозов);

-сапрофитные микобактерии (сапрофиты).

По скорости роста на питательных средах микобактерии подразделяются на

3группы:

-быстрорастущие микобактерии, образующие колонии менее чем за 7 дней (возбудители микобактериозов и представители нормальной микрофлоры);

-медленнорастущие микобактерии, образующие видимые колонии через 7 дней и более (возбудитель туберкулеза);

-микобактерии, не растущие на питательных средах (возбудитель лепры или проказы).

Туберкулез у человека чаще всего вызывают три вида микобактерий: M. tuberculоsis (палочка Коха, человеческий вид - вызывает заболевание в 92% случаев), М. bоvis (бычий вид - вызывает заболевание в 5% случаев), М. аfriсаnum (промежуточный вид - вызывает заболевание в 3% случаев, в Южной Африке – намного чаще). В редких случаях туберкулез у человека вызывают M. microti (мышиный тип) и M. avium (птичий тип, вызывающий инфекцию у лиц с иммунодефицитом).

Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудители туберкулеза характеризуются выраженным полиморфизмом (кокковидные, нитевидные, ветвистые, колбовидные формы). В основном они имеют форму длинных тонких (М. tuberculosis, М. africanum) или коротких и толстых (М. bovis) палочек с зернистой цитоплазмой, содержащей от 2 до 12 зерен различной величины (зерна метафосфатов – зерна Муха). Иногда они образуют нитевидные структуры, напоминающие мицелий грибов, что и послужило основанием для их названия (mykes - гриб и bacterium - бактерия). Неподвижные. Спор не образуют. Имеют микрокапсулу.

Грамположительные. Микобактерии являются кислото-, спирто- и щелочеустойчивыми бактериями. Для их окраски применяют метод ЦиляНильсена (термокислотное протравливание карболовым фуксином). При этом в препаратах микобактерии выглядят в виде ярко-красных палочек, расположенных одиночно или небольшими скоплениями из 2-3 клеток.

Культуральные свойства. Облигатные аэробы. Растут медленно из-за наличия в клеточной стенке липидов, замедляющих обмен веществ с окружающей средой. Оптимальная температура роста 37-38ºС. Оптимальное значение рН 6,8-7,2. Микобактерии требовательны к питательным средам, глицеринзависимые. Для подавления токсического действия образуемых в процессе метаболизма жирных кислот к средам добавляют активированный уголь, сыворотки крови животных и

4

альбумин, а для подавления роста сопутствующей микрофлоры - красители (малахитовый зеленый) и антибиотики, не действующие на микобактерии.

Элективные питательные среды для микобактерий:

-яичные среды Левенштейна-Йенсена, Финна-2;

-глицериновые среды Миддлбрука;

-картофельные среды с желчью;

-полусинтетическая среда Школьниковой;

-синтетические среды Сотона, Дюбо.

На плотных средах на 15-20 день инкубирования микобактерии образуют шероховатые плотные колонии кремового цвета бородавчатого вида (напоминают

цветную капусту).

В жидких средах через 5-7 дней образует на поверхности толстую сухую морщинистую пленку кремового цвета. При этом бульон остается прозрачным.

Для экспресс-диагностики используют метод микрокультивирования на стеклах в жидкой среде (метод микрокультур Прайса), при котором через 48-72 часа отмечается рост микобактерий в виде переплетенных девичьих “кос” или “жгутов” благодаря корд-фактору (англ. cord - жгут, веревка).

Химический состав. Основные компоненты микобактерий: белки (туберкулопротеины), углеводы и липиды.

Туберкулопротеины составляют 56% сухой массы вещества микробной клетки. Они являются основными носителями антигенных свойств микобактерий, высокотоксичны, вызывают развитие реакции гиперчувствительности 4-го типа.

На долю полисахаридов приходится 15% сухой массы вещества микобактерий.

На долю липидов приходится от 10 до 40% сухой массы вещества микобактерий. Высокое содержание липидов определяет кислото-, спирто- и щелочеустойчивость возбудителя, вирулентность, трудность окрашивания клеток обычными методами и устойчивость в окружающей среде. Липиды экранируют бактериальную клетку, подавляют фагоцитоз, блокируют активность клеточных ферментов, вызывают развитие гранулем и казеозного некроза.

Резистентность. В высохшей мокроте больного клетки сохраняют жизнеспособность и вирулентность в течение 5-6 месяцев. На предметах больного сохраняются более 3 месяцев. В почве сохраняются до 6 месяцев, в воде – до 15 месяцев. Солнечный свет вызывает гибель микобактерий через 1,5 часа, УФЛ – через 2-3 минуты. При пастеризации погибают через 30 минут. Хлорсодержащие препараты вызывают гибель возбудителей туберкулеза в течение 3-5 часов, 5%-ный раствор фенола - через 6 часов.

Факторы патогенности микобактерий:

-корд-фактор – гликолипид клеточной стенки, вызывает повреждение клеточных мембран и ингибирует образование фаголизосомы, обусловливая развитие незавершенного фагоцитоза;

-липиды, содержащие миколовую и фтионовую кислоты, вызывают появление многочисленных гигантских клеток;

Возбудители туберкулеза не образуют экзотоксинов. Высокотоксичными являются продукты распада клеток.

5

Главным фактором патогенности микобактерий является корд-фактор (название происходит от англ. соrd - жгут, веревка). Корд-фактор обусловливает “скученный тип роста” в жидких средах в виде “извилистых тяжей” (или кос), в которых клетки микобактерий располагаются параллельными цепочками.

Эпидемиология. Туберкулез распространен повсеместно. Основной источник инфекции - больной человек с туберкулезом органов дыхания, выделяющий микробы в окружающую среду с мокротой. Источниками инфекции могут также быть люди с внелегочными формами туберкулеза и больные животные (крупный рогатый скот, верблюды, свиньи, козы и овцы). Основной механизм заражения – аэрогенный. Пути передачи возбудителя - воздушно-капельный и воздушно-пылевой. Входными воротами при этом является слизистая оболочка полости рта, бронхи и легкие. Реже заражение туберкулезом может происходить алиментарным (пищевым) путем при употреблении термически не обработанных мясо-молочных продуктов. Возможен контактно-бытовой путь передачи инфекции от больных туберкулезом при использовании инфицированной одежды, игрушек, книг, посуды и других предметов. Известны случаи заражения людей при уходе за больными животными.

Патогенез. Проникнув в организм человека, микобактерии фагоцитируются. В фагоцитах формируются фагосомы, внутри которых микобактерии остаются живыми и размножаются. В фагоцитах микобактерии транспортируются в регионарные лимфатические узлы, сохраняясь длительное время в “дремлющем” состоянии (незавершенный фагоцитоз). При этом происходит воспаление лимфатических путей (лимфангоит) и лимфатических узлов (лимфаденит). В месте внедрения возбудителя формируется очаг воспаления. Это воспаление в течение нескольких недель приобретает специфический характер (развивается реакция гиперчувствительности замедленного типа), в результате чего формируется гранулема. В последующем происходит трансформация макрофагов в эпителиоидные клетки. При слиянии эпителиоидных клеток образуются гигантские многоядерные клетки. Вокруг очага воспаления формируется соединительнотканная капсула, некротизированные ткани обызвествляются. В результате этого происходит формирование первичного туберкулезного комплекса, внутри которого находится казеозная некротизированная ткань и остаются живые микобактерии.

Клиника. Инкубационный период длится от 3-8 недель до 1 года и более.

Клинические проявления туберкулеза многообразны, поскольку микобактерии могут поражать любые органы (кишечник, мочеполовые органы, кожу, суставы). Симптомами туберкулеза являются быстрая утомляемость, слабость, потеря массы тела, длительная субфебрильная температура, обильное ночное потоотделение, кашель с мокротой с кровью, одышкой. Симптомов, характерных только для туберкулеза, нет. При поражении кожи отмечаются изъязвленные очаги. При туберкулезе костей и суставов возникают поражения, характерные для артритов любой этиологии: истончение хрящей, возникновение шипов, сужение полостей суставов.

Иммунитет. Противотуберкулезный иммунитет формируется в ответ на проникновение в организм микобактерий в процессе инфицирования или вакцинации и носит нестерильный характер, что обусловлено длительной персистенцией бактерий в организме. Он проявляется через 4-8 недель после

6

попадания микробов в организм. Формируется как клеточный, так и гуморальный иммунитет.

Клеточный иммунитет проявляется состоянием повышенной чувствительности (сенсибилизации). Благодаря этому организм приобретает способность быстро связывать новую дозу возбудителя и удалять ее из организма: Т-лимфоциты распознают клетки, инфицированные микобактериями, атакуют их и разрушают.

Гуморальный иммунитет проявляется синтезом антител к антигенам микобактерий. Образуются циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), которые способствуют удалению антигенов из организма.

Иммунитет при туберкулезе сохраняется до тех пор, пока в организме есть возбудитель. Такой иммунитет называют нестерильным. После освобождения организма от микобактерий иммунитет быстро исчезает.

Микробиологическая диагностика. Исследуемый материал - мокрота,

аспират бронхов, отделяемое свищей, СМЖ, моча, испражнения. Чаще всего исследуют мокроту. Для диагностики туберкулеза применяют основные и дополнительные методы исследования.

Основные методы:

-бактериоскопический метод (световая и люминесцентная микроскопия);

-бактериологический метод.

Дополнительные методы:

-биологический метод;

-серологический метод;

-кожные аллергические пробы;

-молекулярно-биологический метод (ПЦР).

Бактериоскопическое исследование – микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену. В препаратах можно обнаружить единичные микроорганизмы, если в 1 мл мокроты их содержится не менее 10000-100000 бактериальных клеток (предел метода). Этот метод применяется:

-при обследовании лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 недель, боли в грудной клетке, кровохарканье, потеря массы тела);

-у лиц, контактировавших с больными туберкулезом;

-у лиц, имеющих рентгенологические изменения в легких, подозрительные на туберкулез.

При получении отрицательных результатов микроскопического исследования прибегают к методам обогащения материала: центрифугированию (седиментации) и флотации.

Метод центрифугирования – исследуемый материал обрабатывают щелочью и центрифугируют. Препарат для микроскопирования готовят из осадка.

Метод флотации – исследуемый материал обрабатывают смесью щелочи и ксилола (бензина, бензола, толуола). Пробу энергично встряхивают 10-15 минут, добавляют дистиллированную воду и выдерживают в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Капельки углевода адсорбируют микобактерии и всплывают, образуя на поверхности пену. Препарат для микроскопирования готовят из образующейся пены.

7

Бактериологическое исследование проводят путем высева исследуемого материала (после обработки 6-12% раствором серной кислоты) на 2-3 различные по составу питательные среды одновременно. В качестве ускоренных методов бактериологической диагностики, для сокращения времени выделения и идентификации возбудителя до 3-4 дней, применяют метод микрокультур (метод Прайса), а также полностью автоматизированные коммерческие системы бульонного культивирования.

Бактериологический метод позволяет получить чистую культуру для определения ее вирулентности и чувствительности к лекарственным препаратам. Этот метод широко применяется для контроля эффективности проводимой терапии.

Биологическая проба наиболее чувствительна, так как позволяет обнаружить от 1 до 5 микробных клеток в исследуемом материале. Метод используется при исследовании биопсийного материала, а также при получении отрицательных результатов при использовании бактериоскопического и бактериологического методов исследования. Для этого морским свинкам подкожно или внутрибрюшинно вводят исследуемый материал (1 мл). При наличии в материале возбудителя через 1-2 месяца у животных развивается генерализованный туберкулез с летальным исходом.

Серологический метод. Предложены РСК, РНГА, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, определение ЦИК.

Туберкулинодиагностика основана на определении повышенной чувствительности организма к туберкулину (в результате заражения возбудителями туберкулеза или специфической вакцинации) с помощью кожных аллергических проб. Для постановки кожной аллергической пробы используют туберкулин. Туберкулин - это общее название препаратов, полученных из микобактерии человеческого или бычьего типов:

-старый туберкулин Коха - АТК (Alt Tuberculin Косh), впервые получен в 1880 г. Р. Кохом. Представляет собой фильтрат автоклавированной 5-6-недельной бульонной культуры микобактерий туберкулеза;

-сухой очищенный туберкулин - РРD (Purified Protein Derivative),

полученный из культур M. tuberculosis и M. bovis;

-очищенный туберкулин, приготовленный М.А. Линниковой (РРD-L) из культур M. tuberculosis и M. bovis.

Для диагностики туберкулеза первоначально использовали накожную пробу Пирке (скарификационную). В настоящее время с целью своевременного выявления первичного инфицирования детей и подростков применяется внутрикожная проба Манту. При постановке пробы Манту туберкулин вводят строго внутрикожно на внутреннюю поверхность средней трети предплечья до образования “пуговки”. Результаты пробы учитывают через 48-72 часа по наличию папулы. Проба Манту оценивается следующим образом:

-отрицательная - наличие реакции от укола до 2 мм в диаметре;

-сомнительная - папула диаметром 2-4 мм или гиперемия;

-положительная - папула диаметром 5-17 мм у детей и подростков и 5-21 мм

увзрослых;

-гиперергическая - папула диаметром более 17 мм у детей и подростков и более 21 мм у взрослых.

8

Туберкулиновая реакция становится положительной через 4-6 недель после инфицирования или вакцинации. После вакцинации положительные реакции на туберкулин сохраняются в течение 3-7 лет. Положительный результат нельзя рассматривать как признак активного процесса. Положительная проба Манту указывает, что человек ранее был инфицирован микобактериями. Люди с положительными туберкулиновыми пробами подвержены риску заболевания в результате активации первичного очага. Если у взрослых положительная реакция свидетельствует об инфицировании, то у детей, ранее не реагировавших на туберкулин, появление впервые зарегистрированной положительной реакции (вираж туберкулиновой пробы) указывает на недавнее заражение и служит показанием для проведения клинического обследования.

При отрицательной реакции риск активизации первичного очага отсутствует, но существует опасность первичного инфицирования. Отрицательная проба отмечается у здоровых неинфицированных лиц, а также у больных промежуточными формами туберкулеза.

Для экспресс-диагностики туберкулеза применяют РИФ с использованием видоспецифических моноклональных антител, метод лазерной флюоресценции, микробиочипы, а также ПЦР, позволяющую сократить исследования до 2 суток.

Лечение. Антибиотикотерапия - основной метод лечения туберкулеза. По степени эффективности противотуберкулезные препараты делятся на 3 группы:

-группа А - наиболее эффективные препараты: изониазид (антиметаболит, аналог изоникотиновой кислоты, ингибирует синтез ферментов, участвующих в синтезе миколовых кислот, которые входят в состав клеточной стенки микобактерий), рифампицин и их производные. Получены препараты, превосходящие рифампицин по лечебным свойствам (рифапентин и рифабутин), а также комбинированные препараты (рифатер, рифанг и т. д.);

-группа В - препараты средней эффективности: этамбутол (синтетический препарат, ингибирует ферменты, участвующие в синтезе клеточной стенки микобактерий, активен только в отношении размножающихся бактерий), канамицин, стрептомицин, циклосерин, этионамид (протионамид), пиразинамид, флоримицин, производные фторхинолонов;

-группа С - малые противотуберкулезные препараты (ПАСК и тибон или тиоцетозон).

Очень быстро появляются штаммы микобактерий, резистентные к противотуберкулезным препаратам. Поэтому используют комбинации препаратов с разным механизмом действия, а также производят частую замену препаратов. Это замедляет появление устойчивых форм. В современных схемах лечения применяют одновременно по 3-5 препаратов (трех-пятикомпонентные схемы лечения).

Специфическая профилактика. Специфическую профилактику осуществляют путем введения живой вакцины ВСG (Bacille Calmette-Guerin). Штамм BCG селекционирован в 1919 г. Альбером Кальметтом и Камилем Гереном путем длительного пассирования M. bovis на картофельно-глицериновой среде с добавлением желчи.

Вакцинацию проводят у новорожденных на 3-7-й день жизни внутрикожно. На месте введения вакцины формируется инфильтрат с небольшим узелком в центре. Обратное развитие инфильтрата происходит в течение 3-5 месяцев.

9

Ревакцинация – в 7 и 14 лет лицам с отрицательной реакцией Манту, поэтому перед ее проведением ставится проба Манту. У новорожденных со сниженной резистентностью и в регионах, благополучных по туберкулезу, применяется менее реактогенная вакцина ВСG-М, содержащая в 2 раза меньшее количество микробов.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

1.Студенты готовят препараты из культур непатогенных микобактерий, окрашивают их по Цилю-Нильсену, микроскопируют, зарисовывают в рабочую тетрадь.

2.В рабочей тетради студенты зарисовывают схему лабораторной диагностики туберкулеза.

7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки темы:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.