Занятие №25

ГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №28 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

2.Цели занятия: Изучить со студентами принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение принципов лабораторной диагностики вирусных инфекций.

3.2.Изучение методов лабораторной диагностики вирусных инфекций.

3.3.Выполнение самостоятельной работы.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

1.Сущность вирусоскопического исследования.

2.Использование культуры клеток в вирусологических исследованиях.

3.Применение куриных эмбрионов в вирусологических исследованиях.

4.Использование лабораторных животных в практике вирусологических исследований.

5.Применение серологических реакций в вирусологической практике.

6.Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка Разделы диагностики вирусных инфекций:

1. Клинико-эпидемиологический диагноз:

-анализ эпидемической обстановки;

-клинические проявления заболевания. 2. Лабораторные методы диагностики.

К данным эпидемической обстановки относятся сведения о скорости

распространения болезни, об охвате инфекцией населения, о случаях смерти, сезонности, наличии переносчиков инфекции, вакцинации людей против данной инфекции и др.

Клинические признаки болезни включают данные о температуре, пульсе, дыхании, состоянии кожных покровов и другие симптомы.

Тщательный анализ полученных сведений позволяет поставить клиникоэпидемический диагноз, который носит только предварительный характер. Для

3

того чтобы поставить окончательный диагноз на вирусное заболевание, необходимо располагать данными лабораторных исследований материала, взятого от больных.

Лабораторные методы диагностики вирусных инфекций включают следующие процедуры

-вирусоскопическое исследование препаратов;

-выделение и идентификация возбудителя;

-обнаружение антигенов вирусов в образцах исследуемого материала;

-обнаружение и определение титров противовирусных антител.

Вирусоскопическое исследование препаратов при диагностике вирусных

заболеваний проводится с помощью экспресс-методов, позволяющих обнаружить в патологическом материале вирусные антигены, тельца-включения и элементарные тельца.

Для обнаружения вирусных антигенов в патологическом материале используют наиболее чувствительные методы, так как концентрация антигенов в нем обычно бывает низкой. Наиболее широко используют РИФ (реакция иммунофлуоресценции). Для этого из патологического материала готовят мазкиотпечатки или срезы, которые обрабатывают гипериммунными сыворотками, мечеными флуорохромами. Препараты просматриваются с помощью люминесцентного микроскопа.

У гемагглютинирующих вирусов вирусные гемагглютинины в материале обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации. Явление гемагглютинации - склеивание эритроцитов крови в присутствии вируса.

Тельца-включения - это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках в результате репродукции в них некоторых вирусов. Как правило, РНКсодержащие вирусы образуют цитоплазматические включения, ДНК-содержащие вирусы - внутриядерные. Наиболее известны тельца Бабеша-Негри, образуемые вирусом бешенства в цитоплазме нервных клеток. Обнаружение телец-включений при вирусных болезнях имеет лишь вспомогательное диагностическое значение.

Крупные вирусы (элементарные тельца) в исследуемом материале обнаруживают под обычным световым микроскопом после их обработки солями тяжелых металлов (например, элементарные тельца при оспе).

Выделение и идентификация вирусов.

Выделение и идентификация возбудителя - главное в диагностике вирусных инфекций. Для выделения вирусов используют следующие биологические системы:

-культуры клеток;

-куриные эмбрионы;

-животные модели.

1. Культуры клеток. Для заражения культуры клеток во флаконы с монослоем вносят небольшое количество вируссодержащей суспензии. Затем добавляют поддерживающую питательную среду и помещают в термостат. В лабораториях используют следующие виды клеточных культур:

а) Первично-трипсинизированные культуры. б) Полуперевиваемые культуры.

в) Перевиваемые культуры.

Признаками размножения вируса в культуре клеток является изменение морфологии клеток, их округление, гибель, фрагментация и другие изменения.

4

2. Куриные эмбрионы.

Заражение куриных эмбрионов проводят следующими способами:

-на хорион-аллантоисную мембрану;

-в амниотическую полость;

-в аллантоисную полость;

-в желточный мешок.

Признаками размножения вируса в куриных эмбрионах являются их гибель и патологоанатомические изменения на оболочках эмбриона.

3. Животные модели. Наиболее часто используют белых мышей, белых крыс, хомячков, морских свинок, кроликов. Выбор метода заражения зависит от тропизма вирусов и чувствительности животного. За зараженными животными устанавливают контроль, отмечая изменение в их поведении, появление специфических признаков болезни. Признаками репродукции вирусов в организме животных являются их гибель, клинические симптомы болезни и патологоанатомические изменения в тканях павших животных.

Идентификация вирусов. После выделения вирусов их необходимо идентифицировать, то есть определить виды выделенных вирусов. Идентификацию вирусов осуществляют по количественным и качественным признакам, а также по морфологии вирусных частиц.

1. Качественное определение. Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических признаков, гибель и т. д.), куриных эмбрионах и культурах клеток. Факт размножения вирусов в культурах клеток in vitro определяют по следующим критериям:

-цитопатические эффекты;

-бляшкообразование;

-тельца включений;

-феномен гемадсорбции;

-“цветная реакция”.

Цитопатические эффекты (ЦПД - цитопатическое действие, ЦПЭ - цитопатический эффект) оценивают при микроскопии клеточных культур. ЦПД - это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в ней вируса. Оно устанавливается под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД разнообразны - от едва заметных изменений в цитоплазме до полного распада клеток на фрагменты.

Бляшкообразование. Бляшки – это участки разрушенных клеток (зоны просветления) на монослое клеток, покрытом слоем агара.

Тельца включений – это скоплениия вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).

Феномен гемадсорбции - это прилипание эритроцитов к поверхности клеток, зараженных гемагглютинирующим вирусом. Для наблюдения гемадсорбции необходимо из флакона с зараженной вирусом культурой клеток удалить культуральную жидкость и добавить 2-3 капли 2,5%-ной суспензии эритроцитов. Флаконы оставляют в горизонтальном положении в течение 10 минут, затем слой клеток споласкивают физраствором, чтобы смыть эритроциты. Если в зараженной

5

культуре клеток происходит репродукция вируса, на таких клетках под микроскопом можно видеть адсорбировавшие эритроциты.

“Цветная реакция”. В культуральную среду, используемую для поддержания клеток, вносят индикатор. Рост клеток сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом рН среды и изменением окраски индикатора. Заражение культур вирусом резко ингибирует клеточный метаболизм, и среда сохраняет первоначальный цвет.

2. Количественное определение вирусов проводят двумя путями:

-изучением инфекционности;

-электронной микроскопией.

Определение инфекционности вирусов. Наиболее доступная форма количественного определения - подсчет числа вирусных бляшек. Прямые тесты на инфекционность применяют для установления инфекционной дозы (ИД) или летальной дозы (ЛД) изучаемого вируса (обычно выражают в lg). ИД50 - разведение, инфицирующее 50% клеток; ЛД50 - разведение, убивающее 50% пораженных клеток или животных.

Количественную электронную микроскопию применяют для подсчета общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом объекте (например, культуральной жидкости). Однако чаще всего этот метод недоступен изза отсутствия столь дорогого и сложного прибора.

Серологические методы диагностики вирусных болезней.

В вирусологии широко используют следующие серологические реакции:

-нейтрализации – РН;

-торможения гемагглютинации – РТГА;

-непрямой гемагглютинации – РНГА;

-связывания комплемента – РСК;

-диффузной преципитации – РДП;

-торможения гемадсорбции – РТГАд;

-иммунофлуоресценции - РИФ.

1.Реакция нейтрализации (РН) основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными антителами. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных антител.

Реакция нейтрализации ставится в двух модификациях:

а) с разными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного вируса для обнаружения и титрования неизвестных противовирусных антител;

б) с постоянным разведением известной гипериммунной сыворотки и разными дозами вируса для идентификации неизвестного выделенного вируса по индексу нейтрализации.

2.Реакция торможения гемагглютинации - РТГА. Ее принцип состоит в том, что при контакте вируса с гомологичными антителами происходит связывание антител с гемагглютининами вируса, в результате чего вирус теряет свойство агглютинировать (склеивать) эритроциты. Для этого исследуемую сыворотку в разных разведениях смешивают с одинаковыми дозами известного вируса и после контакта ко всем смесям добавляют суспензию эритроцитов, которые служат

6

индикатором вирусных гемагглютининов. При высшем разведении исследуемой сыворотки, когда еще подавляется гемагглютинация, и определится титр антител в этой сыворотке.

3.Реакция непрямой гемагглютинации - РНГА. Ее принцип состоит в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы вирусы, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных антител, содержащихся в исследуемой сыворотке крови. РНГА позволяет обнаруживать и титровать антитела. За титр антител в сыворотке крови принимают наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию сенсибилизированных вирусом эритроцитов. РНГА можно поставить макро- и микрометодами.

4.Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при ее отсутствии делают заключение о несоответствии вируса используемой антисыворотке.

5.Реакция связывания комплемента (РСК). На первом этапе в реакции участвуют антиген и антитело, а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии вирусного антигена и специфического к нему антитела образуется комплекс, и он связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы, состоящей из бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки кролика. Если комплемент связался при взаимодействии вирусного антигена и специфических к нему антител, то лизис (растворение) бараньих эритроцитов не происходит, что свидетельствует о положительной РСК. При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов, по которому судят о результатах реакций.

6.Реакция диффузной преципитации (РДП) основана на способности специфических антител сыворотки крови и специфических растворимых вирусных антигенов диффундировать в толще агарового геля навстречу друг другу, в результате чего образуется комплекс “антиген+антитело”. Этот комплекс не обладает способностью диффундировать в агар и выпадает в осадок на месте образования в виде полосы преципитации, видимой невооруженным глазом. Если же антитела и антиген не соответствуют (негомологичны) друг другу, то полосы преципитации не образуются, что свидетельствует об отрицательной РДП.

7.Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой, содержащей антитела к этому вирусу. Она позволяет идентифицировать гемагглютинирующий вирус в культуре клеток намного раньше появления отчетливых цитопатических изменений в пораженных вирусом клетках.

8.Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Ее сущность состоит в обработке препаратов-отпечатков из патологического материала сывороткой крови, содержащей специфические антитела к определенному вирусу и обработанной флуорохромом (веществом, способным светиться при облучении светом). Если вирусный антиген и меченая сыворотка, содержащая специфические к данному вирусу антитела, соответствуют друг другу, то происходит образование комплекса "антиген+антитело", и он обнаруживается с помощью люминесцентного микроскопа

7

по специфическому свечению. Наибольшее распространение получила реакция

прямой иммунофлюоресценции.

9.Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода)

позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами антитела, но сложность и дороговизна метода ограничивает его применение.

10.К методам, основанным на принципе использования меченых антител, относится иммуноферментный анализ (ИФА). Принцип метода состоит в обнаружении антигена, фиксированного на очередном носителе, специфическими глобулинами, мечеными ферментами (пероксидаза хрена, кислая или щелочная фосфатаза). Фермент проявляют различными субстратами, дающими с ним характерное окрашивание, которое определяют фотометрическим методом.

11.Радиоиммунный метод основан на использовании меченого радиоактивным йодом антигена. Антиген, соединяясь с антителом, образует меченый иммунный комплекс антиген-антитело. Результат определяют на счетчике.

12.Метод иммуноэлектрофореза основан на способности антигенов и антител диффундировать в геле под действием электрического поля.

13.Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов.

Реакцию торможения цитопатического эффекта за счет интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на нее), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в нее вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым антителам.

Гибридизация ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключенные в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

1. Выполнение тестовых заданий.

8

2. Зарисовка в рабочих тетрадях схем применения в вирусологических исследованиях биологических систем (культур клеток, куриных эмбрионов, лабораторных животных).

7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки темы:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.