Занятие №23

ГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №23 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Патогенные клостридии и клостридиозы. Возбудители столбняка,

анаэробной раневой инфекции, ботулизма.

2.Цели занятия: Изучить со студентами свойства возбудителей столбняка, анаэробной раневой инфекции, ботулизма, факторы патогенности возбудителей, патогенез, методы диагностики, профилактики и лечения вызываемых ими заболеваний.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение свойств возбудителя столбняка.

3.2.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения столбняка.

3.3.Изучение свойств возбудителя анаэробной раневой инфекции.

3.4.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения анаэробной раневой инфекции.

3.5.Изучение свойств возбудителя ботулизма.

3.6.Изучение методов диагностики, профилактики и лечения ботулизма.

3.7.Выполнение самостоятельной работы.

3

6.3. Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка

Спорообразующие бактерии рода Clostridium

Род Clostridium семейства Clostridiaceae отдела Firmicutes образуют подвижные (перитрихи) или неподвижные палочки. Род Clostridium включает более 120 видов, в том числе более 20 видов – патогенные для человека виды (Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium perfringens и другие). Название рода происходит от слов kloster, closter – веретено.

Общие признаки клостридий:

-анаэробы;

-крупные грамположительные палочки;

-спорообразование (диаметр спор больше поперечника клетки);

-токсинообразование.

Клостридии являются возбудителями заболеваний, называемых клостридиозами. Различают энтеральные клостридиозы (в частности, ботулизм) и

раневые (травматические) клостридиозы (например, столбняк, газовая гангрена).

1. Возбудитель столбняка

Столбняк (tetanus) - раневая инфекция с поражением нервной системы и приступами судорог. Возбудитель заболевания - С. tetani. Практически одновременно возбудитель открыли русский ученый Н.Д. Монастырский (1883) и А. Николайер (1884). В чистой культуре бактерии впервые выделил японский микробиолог Ш. Китазато (1887). Он же в 1890 г. получил столбнячный токсин и совместно с немецким бактериологом Э. Берингом приготовил противостолбнячную сыворотку. В 1923 г. французский иммунолог Г. Рамон получил столбнячный анатоксин, который стал использоваться для профилактики этого заболевания. Анатоксин получают путем добавления к токсину формалина с последующим инкубированием при 37ОС в течение 1 месяца.

Морфологические и тинкториальные свойства. Крупные грамположитель-

ные палочки с закруглёнными концами длиной 4-8 мкм и толщиной 0,3-0,8 мкм. Подвижные (содержат более 20 жгутиков, расположенных перитрихиально). Не образуют капсул. В мазках располагаются одиночно или короткими цепочками. Образует споры круглой формы, располагающиеся терминально, что придает клетке со спорой вид барабанной палочки.

Культуральные свойства. С. tetani - строгий анаэроб. На МПА и в желатине возбудитель растёт медленно, образует тонкие прозрачные колонии двух типов: гладкие прозрачные S-колонии и серовато-жёлтые шероховатые R-колонии. На агаровых средах в анаэробных условиях образуются сливающиеся паукообразные колонии с отростками (вид “сеточки”). Растет при температуре от 14 до 45°С.

Биохимические свойства. Сахаролитическими свойствами не обладает, лишь немногие штаммы ферментируют глюкозу. С. tetani проявляет слабые протеолитические свойства.

Антигенная структура. У С. tetani выявляют О- и Н-антигены. По жгутиковым Н-антигенам выделяют 10 сероваров.

Резистентность. Споры возбудителя столбняка выдерживают нагревание до 90°C в течение 2 часов, при кипячении погибают через 1-3 часа, выдерживают

4

нагревание до 150°C, выживают в течение 8-10 часов в 1% растворе сулемы и 5% растворе фенола. В почве сохраняются более 10 лет. Столбнячный токсин инактивируется при 65°С в течение 5 минут, легко разрушается ферментами желудочно-кишечного тракта.

Эпидемиология. Естественный резервуар и источник инфекции - почва.

Механизм передачи возбудителя – контактный. Путь передачи - раневой (бытовые

ипроизводственные травмы, ранения, ожоги, обморожения, операционные раны, инъекционные раны). Заражение человека является чаще всего следствием бытовых

ипроизводственных травм. Основная группа риска в мирное время - работники сельского хозяйства. Больной человек для окружающих не опасен.

Факторы патогенности. Главным фактором патогенности С. tetani является экзотоксин, который состоит из двух фракций - тетаноспазмина (нейротоксина) и тетанолизина (гемолизина).

Тетаноспазмин выделяется при распаде микробных клеток. Он вызывает сокращения мышц.

Тетанолизин выделяется из клеток путем активного транспорта. Он разрушает эритроциты и обладает кардиотоксическим действием.

Экзотоксин при обработке формалином и прогревании превращается в анатоксин (токсоид), который применяют для специфической профилактики столбняка.

Патогенез. Возбудитель столбняка локализуется в месте входных ворот (в ране), где размножается и выделяет экзотоксин. Тетаноспазмин проникает в кровь, распространяется по кровеносным сосудам и достигает мионевральных синапсов. Затем тетаноспазмин фиксируется на пресинаптической мембране нервных клеток и проникает в них путем эндоцитоза. Механизм действия связан с подавлением высвобождения тормозных нейромедиаторов в синапсах (токсин связывается с синаптическим белком синаптобревином). В результате этого в мышцу не поступают тормозящие импульсы и развиваются длительное напряжение и болезненное сокращение мышц.

Клиника. В зависимости от способа заражения различают:

-посттравматический столбняк (летальность – 45-50%);

-послеоперационный столбняк;

-послеродовой столбняк (пупочный столбняк новорожденных), летальность до 90%;

-постинъекционный столбняк.

Выделяют следующие периоды заболевания:

Инкубационный период при столбняке составляет 6-14 дней. Чем короче инкубационный период, тем тяжелее протекает болезнь.

Начальный период продолжается до 2 дней. Наиболее ранний симптом - появление тупых тянущих болей в области входных ворот инфекции, где к этому времени может наблюдаться полное заживление раны.

Период разгара продолжается в среднем 8-12 дней, в тяжелых случаях до 2-3 недель. Основное проявление столбняка - судорожный синдром: болезненные сокращения мышц (тетанус) и длительное напряжение мышц (мышечная ригидность).

5

Период выздоровления продолжается до 2 месяцев и характеризуется постепенным снижением силы и количества судорог и напряжения мышц.

Впериод разгара болезни развивается тризм - напряжение и судорожное сокращение жевательных мышц. Судороги мимических мышц приводят к развитию сардонической улыбки или оскала: брови подняты, рот растянут в ширину, углы его опущены, лицо выражает одновременно улыбку и плач (Risus sardonicus или risus caninus - сардоническая улыбка или оскал).

Вдальнейшем возникает болезненное напряжение вначале мышц затылка, а затем мышц шеи, спины, живота и конечностей. Развивается тетанический спазм мышц всего тела (опистотонус). При этом тело изгибается дугой. Больной находится в полном сознании. Смерть наступает от паралича сердца либо от асфиксии вследствие поражения мышц гортани, межреберных мышц и диафрагмы.

Столбняк новорожденных также проявляется тетаническим спазмом мышц всего тела.

Иммунитет после заболевания не формируется.

Лабораторная диагностика. Диагностика столбняка основана на клинической картине заболевания. Лабораторные исследования проводят при неясных случаях.

Исследуемый материал: отделяемое ран, кусочки тканей, перевязочный материал, кровь, секционный материал, почва. Бактерии обычно обнаруживают в месте входных ворот инфекции. В тех случаях, когда входные ворота неизвестны, следует тщательно осмотреть больного для выявления ссадин, царапин и воспалительных процессов. Особо следует обратить внимание на старые рубцы после ранений, так как возбудитель может долго в них сохраняться.

Исследование проводится в двух направлениях:

-обнаружение токсина путем постановки биопробы;

-обнаружение возбудителя.

Для обнаружения токсина проводят реакцию нейтрализации на лабораторных животных (биопробу). Подкожное введение мышам фильтрата исследуемого материала (токсина) приводит к спазму мышц и искривлению тела в сторону места введения токсина.

Обнаружение возбудителя производится путем бактериоскопического и бактериологического исследования материала с места входных ворот инфекции.

Бактериоскопическое исследование – обнаружение в мазках бактерий характерной формы (“барабанных палочек”).

Бактериологическое исследование (выделение возбудителя) производится путем посева на среду Китта-Тароцци с последующим пересевом на плотные среды.

Лечение проводится в стационаре. Больной помещается в отдельную затемненную палату, где исключается возможность воздействия внешних раздражителей (шум, свет и т. д.). Для специфического лечения применяют

противостолбнячную антитоксическую сыворотку (антитоксин), полученную путем гипериммунизации лошадей столбнячным анатоксином. Используют также донорский противостолбнячный иммуноглобулин. Наряду с введением сыворотки используют антибиотики.

Иммунопрофилактика. Проводят плановые и экстренные мероприятия.

6

Специфическая плановая профилактика проводится в 3-5 месяцев столбнячным анатоксином, сорбированным на гидроокиси алюминия, с последующей периодической ревакцинацией (АКДС-вакцина, АДСм-анатоксин, АСм-анатоксин, секстанатоксин).

Экстренная профилактика применяется при ранениях и травмах с нарушением целостности кожных покровов и слизистых оболочек, при ожогах, обморожениях и включает в себя пассивную иммунизацию (однократное введение противостолбнячной антитоксической лошадиной сыворотки) или активнопассивную иммунизацию (введение столбнячного анатоксина и противостолбнячного иммуноглобулина человека).

2. Возбудители анаэробной раневой инфекции (газовой гангрены) Анаэробная раневая инфекция (газовая гангрена - греч. gangraina -

разъедающая язва) характеризуется выраженной интоксикацией, прогрессирующим некрозом мышечных тканей, крепитирующими отеками окружающих тканей. Выраженное воспаление тканей при анаэробной инфекции отсутствует.

Заболевание известно с древних времен. Классическое описание симптомов газовой гангрены дал в 1864 г. Н.И. Пирогов.

Возбудители. Основными возбудителями анаэробной газовой гангрены являются С. perfringens, С. novyi, С. septicum. Реже встречаются С. histoliticum, С. bifermentans, С. ramosum, С. sporogenes, С. fallax, С. sordelli и др. Нередко возбудители газовой гангрены обнаруживаются в ранах в ассоциациях не только друг с другом, но и с аэробными пиогенными кокками и гнилостными анаэробными бактериями.

С. perfringens

С. perfringens - один из наиболее распространённых патогенных видов. По способности образовывать четыре главных токсина (α-, β-, ε- и ∆-) микроорганизмы разделяют на шесть сероваров - А, В, С, D, Е и F. Основной возбудитель заболеваний человека - бактерии типа А.

Эпидемиология. С. perfringens распространены повсеместно; бактерии выделяют из воды, почвы и сточных вод, кишечника животных и человека (выделяют у 25-35% здоровых лиц). У человека С. perfringens вызывает два типа поражений - газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции.

Морфология и тинкториальные свойства. Вегетативные клетки представлены короткими крупными палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0x1-1,5 мкм). Грамположительная палочка, образующая капсулу. Споры крупные, овальные, расположены центрально.

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. На среде КиттаТароцци вызывает помутнение и появление пузырьков газа из-под кусочков печени.

На плотных средах бактерии образуют S- и R-колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями, серовато-белого цвета. R- колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями. На кровяном агаре колонии окружены зоной гемолиза. На желточном агаре бактерии образуют колонии, окружённые зоной перламутрового преципитата, образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы.

Биохимические свойства. Бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты и газа, восстанавливают нитраты, расщепляют лактозу, образуют

7

лецитиназу. Протеолитическая активность слабая: разжижает желатин, не разлагает казеин. Интенсивно створаживают молоко с образованием крупноячеистого губчатого сгустка, напоминающего пену на волнах. Это феномен известен как “штормовая реакция”.

Газовая гангрена развивается при попадании С. perfringens в рану, где бактерии активно размножаются в условиях пониженного содержания кислорода. Споры заносятся в рану из внешней среды, а также с кожи или из ЖКТ. Для поражений характерны некроз тканей и образование газа с гнилостным запахом.

C. novyi

Бактерии подробно охарактеризовал американский бактериолог Ф. Нови, в честь которого они получили свое название. Микроорганизм широко распространён в природе, может быть выделен из почвы, а также из ЖКТ животных.

Морфология и культуральные свойства. Вегетативные клетки представляют собой крупные слегка изогнутые подвижные грамположительные палочки размером 4-10x1-2 мкм; перитрихи. Облигатный анаэроб. Споры овальные, расположены субтерминально. Устойчивы к нагреванию (выживают при кипячении в течение 1-2 часов). На плотных средах через 48 часов образуют круглые сочные сероватые полупрозрачные колонии, иногда с зернистой поверхностью и неровными краями.

Биохимические свойства. Бактерии типов А, В и С ферментируют глюкозу, фруктозу и мальтозу, а тип D - только глюкозу; глицерин разлагают все штаммы. Протеолитические свойства у C. novyi выражены слабо; все штаммы разлагают желатин, свёртывают молоко (медленно), но не разлагают свернувшийся яичный белок.

C. septicum

C. septicum - полиморфные подвижные палочки размером 4-5x0,8 мкм. В культурах образуют цепочки. Строгие анаэробы. На поверхности плотных сред образуют блестящие полупрозрачные колонии (диаметром до 4 мм) с неровными краями (имеют тенденцию к ползучему росту). На агаре Цейсслера через 48 часов палочки образуют сплошной нежный налёт, окружённый зоной гемолиза. В столбике 1% агара формируют колонии с отходящими переплетающимися нитями, на 2% агаре колонии имеют вид дисков. Ферментируют некоторые углеводы.

Основными факторами патогенности возбудителей анаэробной газовой инфекции являются экзотоксины. С. perfringens продуцирует 12 токсинов, обладающих гемолитическим, некротизирующим, летальным действием. С. novyi синтезирует 8 токсинов, С. septicum продуцирует 4 экзотоксина. Кроме токсинов эти возбудители продуцируют ферменты агрессии, которые способствуют распространению возбудителя в тканях (лецитиназу, фосфолипазу С, ДНКазу, гиалуронидазу).

Эпидемиология. Естественный резервуар возбудителей анаэробной инфекции – желудочно-кишечный тракт человека и животных, вода, почва, сточные воды. Из организма возбудители выделяются в форме вегетативных клеток, в почве сохраняются в виде спор. Заболевание развивается при попадании возбудителя в рану. C. perfringens является санитарно-показательным микроорганизмом, его присутствие свидетельствует о фекальном загрязнении почвы.

8

Патогенез. Возбудитель попадает в рану и быстро в ней размножается. Размножению клостридий способствуют наличие поврежденных тканей (питательных субстратов) и анаэробные условия в ране. Наиболее благоприятными условиями для размножения возбудителей являются обширные повреждения тканей с нарушением кровообращения, гематомами, размозжением мышц.

При размножении клостридии выделяют экзотоксины и ферменты агрессии, под влиянием которых происходит некроз мышечной и соединительной тканей, повышается проницаемость сосудов, развивается отек тканей, скопление газов в тканях. Экзотоксины и продукты распада тканей обусловливают тяжелую интоксикацию организма.

Клиника. Инкубационный период длится от нескольких часов до 5 дней. Наиболее выраженными симптомами газовой гангрены являются отек и некроз тканей, сопровождающийся крепитацией. Отделяемое ран приобретает неприятный запах. Отмечается лихорадка, в результате действия продуктов некроза тканей развивается острая почечная недостаточность.

Иммунитет непродолжительный.

Материалом для исследований служат биоптаты поражённых тканей, отёчная жидкость, перевязочный и шовный материал, одежда, образцы почвы.

Микроскопия материала позволяет обнаружить крупные грамположительные палочки.

Выделение и идентификация возбудителей. Для выделения используют жидкие и плотные среды. Жидкие среды (среда Китта-Тароцци) используют для накопления возбудителей. С жидких сред проводят пересев на плотные среды. В качестве плотных сред используют агар Цейсслера, кровяной агар и среду Вильсона-Блэра.

Для обнаружения токсинов проводят заражение белых мышей исследуемым материалом. Идентификацию токсинов проводят в реакции нейтрализации со специфическими антитоксическими сыворотками.

Лечение. Главный метод предупреждения газовой гангрены - своевременная и правильная хирургическая обработка ран. С лечебной целью вводят антитоксические сыворотки против наиболее частых возбудителей - С. perfringens, С. novyi, С. septicum и одновременно назначают антибиотики

(пенициллин, аминогликозиды).

Профилактика. Анатоксины Clostridium perfringens и Clostridium novyi

входят в состав секстанатоксина для профилактики анаэробных инфекций (столбнячный анатоксин, ботулинические анатоксины типов А, В, Е, анатоксины Cl. perfringens и Cl. novyi). В случае особо тяжелых ранений, которые могут повлечь развитие газовой гангрены, больному с профилактической целью вводят антитоксические сыворотки против наиболее частых возбудителей - С. perfringens, С. novyi, С. septicum.

3. Возбудитель ботулизма

Ботулизм (лат. botulus – колбаса) – тяжелое пищевое отравление (токсикоинфекция), вызываемое экзотоксином бактерии Сlostridium botulinum. Для ботулизма характерно поражение нервной системы и развитие паралитического синдрома.

9

Возбудитель ботулизма открыл бельгийский бактериолог Эмиль ван Эрменгем (1869), который выделил его из остатков ветчины и органов людей, погибших после употребления этой ветчины.

Морфологические и тинкториальные свойства. С. botulinum - подвижная грамположительная палочка с закруглёнными концами. В мазках располагается одиночно, иногда в виде коротких цепочек. Не образуют капсул. Палочки подвижны за счет перитрихиально расположенных жгутиков. При неблагоприятных условиях образует овальные споры, расположенные терминально или субтерминально, придавая клетке форму теннисной ракетки.

Культуральные свойства. С. botulinum – строгий анаэроб. Бактерии хорошо растут в жидких средах (среда Китта-Тароцци): вызывают помутнение среды и газообразование, отмечается запах прогорклого масла. Из плотных сред используют кровяной сахарный агар, печеночный агар. На печёночном агаре образуют полиморфные звёздчатые колонии, в желатине – сероватые колонии, окружённые зоной разжиженной желатины. Температурный оптимум культивирования – 2535°С, оптимум рН - 7,3-7,6.

Спорообразование. Споры чрезвычайно устойчивы к различным физическим и химическим факторам, выдерживают кипячение в течение 4-5 часов, воздействие высоких концентраций дезинфицирующих средств, сохраняются в продуктах, содержащих до 18% поваренной соли.

Антигенная структура. Имеется соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены. По антигенным свойствам экзотоксина выделяют 7 сероваров С. botulinum - А, В, С (С1 и С2), D, Е, F и G.

Резистентность. В окружающей среде споры сохраняются в течение длительного времени, а при благоприятных условиях прорастают и размножаются. Споры выдерживают кипячение в течение 3-5 часов, автоклавирование – в течение 1-2 часов. В высушенном состоянии сохраняют жизнеспособность десятилетиями. Хорошо переносят низкие температуры. При минус 16°С сохраняются в течение года. Токсин выдерживает кипячение в течение 20 минут.

Эпидемиология. Заболевание регистрируется повсеместно. Естественный

резервуар и источник возбудителя инфекции – почва. Механизм передачи – фекально-оральный. Путь передачи – алиментарный. Попадая в пищевые продукты, споры прорастают и образуют токсин. Наибольшую опасность представляют мясные, рыбные и овощные консервы домашнего приготовления, ветчина, колбасы, маринованные в домашних условиях грибы. Практически все пищевые продукты, загрязненные почвой или содержимым кишечника животных, птиц, рыб могут содержать споры или вегетативные формы возбудителей ботулизма. Однако заболевание может возникнуть только при употреблении в пищу тех продуктов, которые хранились при анаэробных условиях без предварительной термической обработки. В России чаще регистрируются заболевания, связанные с употреблением грибов домашнего консервирования, копченой или вяленой рыбы, в европейских странах - мясных и колбасных изделий, в США - бобовых консервов.

Основным фактором патогенности возбудителя ботулизма является ботулинический экзотоксин. Ботулотоксин - белок, обладающий

нейротоксическим и гемолизирующим действием. Патогенез ботулизма.

10

1.Споры возбудителя ботулизма попадают в пищевые продукты, где прорастают и синтезируют токсин.

2.Токсин вместе с пищевыми продуктами попадает в организм человека, сорбируется на клетках слизистой оболочки кишечника и всасывается в кровь.

3.Вместе с кровью токсин разносится по организму и достигает периферических нервных окончаний, где нарушает передачу сигнала с нервного окончания на мышечное волокно путем блокировки выделения ацетилхолина. В результате этого нарушается передача нервного импульса в мышцу, и развиваются характерные вялые параличи мышц.

Ботулинический токсин синтезируется в виде молекулы полипептида (м. м. 150 кД), которая состоит из 2 цепей – тяжелой (Н-цепи с м. м. 100 кД) и легкой (L- цепи с м. м. 50 кД). Обе цепи соединены между собой дисульфидными связями.

Внорме для передачи сигнала с нервной клетки на мышечное волокно необходим выброс ацетилхолина из нервного окончания в синаптическую щель. Для этого выброса мембрана синаптического пузырька, содержащего ацетилхолин, сливается с пресинаптической мембраной аксона. В процессе выброса участвуют специфические белки нервной клетки.

При ботулизме токсин путем эндоцитоза проникает в нервное окончание. В цитоплазме легкая цепь связывается с белками, которые участвуют в выбросе ацетилхолина из нервного окончания в пресинаптическую щель, и разрушает эти белки. В результате этого не происходит слияния синаптических пузырьков с пресинаптической мембраной, ацетилхолин в синаптическую щель не попадает, и сигнал на мышцу не поступает.

Клиника. Выделяют 4 категории ботулизма:

- классический пищевой ботулизм – интоксикация, обусловленная употреблением накопленного в продукте токсина;

- раневой ботулизм - заболевание, возникающее при размножении возбудителя на раневой поверхности;

- ботулизм новорождённых (детский ботулизм), при котором ботулинический токсин вырабатывается в кишечнике новорожденного, колонизированного C. botulinum, при заглатывании спор (воздух, вода);

- неклассифицированный ботулизм, при котором заболевание не связано с пищей и раной.

Чаще всего встречается пищевой ботулизм, который возникает при употреблении инфицированных продуктов. Инкубационный период колеблется от 2 часов до 4 дней и более в зависимости от дозы токсина.

Вначале появляются желудочно-кишечные расстройства - тошнота, рвота, боли в животе, головная боль.

Затем проявляются нервнопаралитические явления:

-бульбарный синдром (дизартрия, афония, дисфагия);

-офтальмоплегический синдром (диплопия, блефароптоз, анизокория). Бульбарный синдром проявляется в виде дизартрии (осиплости голоса),

афонии (потери голоса), дисфагии (нарушения глотания), гиперсаливация или гипосаливация.