Занятие №27

ГБОУ ВПО “Уральская государственная медицинская академия” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания №27 к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060101.65 Лечебное дело Дисциплина С2.Б.10 Микробиология, вирусология

1.Тема: Вирус клещевого энцефалита. Вирус бешенства.

2.Цели занятия: Изучить со студентами строение вирусов клещевого энцефалита и бешенства, патогенез, методы диагностики, профилактики и лечения вызываемых заболеваний.

3.Задачи занятия:

3.1.Изучение строения вируса клещевого энцефалита, патогенеза, клиники, диагностики, профилактики и лечения вызываемого заболевания.

3.2.Изучение строения вируса бешенства, патогенеза, клиники, диагностики, профилактики и лечения вызываемого заболевания.

3.3.Выполнение самостоятельной работы.

2

4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.

5.Контрольные вопросы по теме:

5.1.Строение и репродукция вируса клещевого энцефалита.

5.2.Эпидемиология клещевого энцефалита.

5.3.Патогенез и клиника клещевого энцефалита.

5.4.Диагностика клещевого энцефалита.

5.5.Специфическая профилактика и лечение клещевого энцефалита.

5.6.Строение и репродукция вируса бешенства.

5.7.Эпидемиология бешенства.

5.8.Патогенез и клиника бешенства.

5.9.Диагностика бешенства.

5.10.Специфическая профилактика и лечение бешенства.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо выполнить:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка

I. Вирус клещевого энцефалита

Клещевой энцефалит - острая природно-очаговая вирусная инфекция с трансмиссивным механизмом передачи и преимущественным поражением центральной нервной системы. Название заболеванию (“весенне-летний энцефалит”) дано А.Г. Пановым, который впервые в 1935 г. описал основные симптомы этой болезни.

3

Таксономия. Возбудитель клещевого энцефалита относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus. Вирус клещевого энцефалита выделили в 1937 г. на Дальнем Востоке Л.А. Зильбер, Е.Н. Левкович, М.П. Чумаков и др. из мозга умерших людей, крови и ликвора больных, а также иксодовых клещей и диких позвоночных животных.

Морфология. Вирус клещевого энцефалита представлен сферическими сложно устроенными вирионами диаметром 37-50 нм. Геном образует однонитевая молекула плюс-РНК, заключённая в капсид с кубическим типом симметрии. Нуклеокапсид имеет форму двадцатигранника. Снаружи нуклеокапсид покрыт суперкапсидом, который состоит из липидной мембраны и встроенных в нее гликопротеиновых шипов длиной около 10 нм. В состав вирусной частицы входят 3 структурных белка: Е1-Е3.

Репродукция вируса. После адсорбции вирус попадает в цитоплазму клетки. Депротеинизация вирусной РНК осуществляется с помощью клеточных протеаз. Синтез вирусных компонентов и сборка дочерних вирусных частиц происходит в цитоплазме. Суперкапсид вируса формируется на клеточных оболочках. После созревания дочерние вирионы отпочковываются от клеточной мембраны.

Устойчивость. Вирус быстро инактивируется спиртом, эфиром, дезрастворами, чувствителен к нагреванию, высушиванию. В организме переносчиков он длительно сохраняет свою жизнеспособность, что способствует его широкому распространению. Он проявляет высокую резистентность к действию кислых значений рН, что важно при алиментарном пути заражения.

Эпидемиология. Основной резервуар и переносчик вируса клещевого энцефалита в природе - иксодовые клещи (Ixodes persulcates - таежный клещ и Ixodes ricinus - лесной или собачий клещ). У клещей при этом происходит трансовариальная и трансфазовая передача вируса. Однако на каждом этапе метаморфоза клещей наблюдается гибель большого числа членистоногих. Поэтому поддержание популяции осуществляется за счет прокормителей клещей - грызунов, птиц, диких и домашних животных, которые являются дополнительным резервуаром. Для клещевого энцефалита характерна весенне-летняя сезонность.

Сезонность инфекции определяется периодом активности перезимовавших в лесной подстилке самок. Этот период длится с появления первой травы до наступления жары.

Человек в большинстве случаев заражается при укусе инфицированными клещами. Проникновение вируса в организм возможно также алиментарно при употреблении сырого молока коз и овец (молочная лихорадка или двухволновый менингоэнцефалит). Употребление коровьего молока обычно не ведет к заражению, так как у коров к периоду лактации появляются вируснейтрализующие антитела.

Патогенез. Вирус содержится в слюне инфицированного клеща. При кровососании в организм человека постепенно попадает значительное количество вируса. Первичное размножение вируса происходит в месте входных ворот инфекции под кожей, откуда он попадает в лимфу и кровь. Возникает первая вирусемия. Вирус проникает в эндотелий кровеносных сосудов, внутренних органов и в фагоцитирующие клетки, где активно размножается. В результате активного размножения вируса в эндотелии кровеносных сосудов возникает

4

вторичная вирусемия. При этом вирус проникает в центральную нервную систему и поражает различные ее отделы. Особенно страдают крупные двигательные клетки в сером веществе спинного мозга и ядрах двигательных черепно-мозговых нервов в стволе головного мозга.

Если зараженные клещи присасываются к козам, то вирус может попасть в последующем в молоко. При пищевом пути заражения входными воротами является слизистая оболочка глотки и тонкой кишки. Вирус размножается в стенке кишечника, попадает с лимфой в кровь и затем в центральную нервную систему. Вирусемия при этом наступает позже, интенсивность ее менее выражена.

Клиника. У большинства пострадавших людей отмечается субклиническое течение. Инкубационный период при этом составляет 7-14 дней. Инфекция начинается остро, с озноба и повышения температуры до38-39°С. Появляется резкая головная боль, чувство разбитости, ломота в конечностях и во всем теле, тошнота и рвота, нарушение сна (сонливость или бессонница). Иногда отмечаются боли в желудке. Лихорадочный период продолжается от 3 до 14 дней. Через 8-20 дней после снижения температуры развивается симптоматика со стороны ЦНС: менингит (50-60% случаев), менингоэнцефалит (30%) и менингоэнцефаломиелит (5%). При поражении центральной нервной системы иногда развиваются симметричные вялые парезы и параличи верхних конечностей и шейно-плечевой мускулатуры, заканчивающиеся атрофией пораженных мышц.

Иногда наблюдается двухволновое течение инфекции: вначале 3-7 дней лихорадки, затем 7-14 дней безлихорадочного периода и повторное повышение температуры. Такое течение характерно для заболевания, возникшего при употреблении в пищу молока зараженных коз.

В большинстве случаев взаимодействие вируса с макроорганизмом протекает бессимптомно, на субклиническом уровне в виде острого (до 6 месяцев) или хронического (свыше 6 месяцев) вирусоносительства.

Диагностика. В начале болезни возможно выделение вируса из крови и спинномозговой жидкости больных, внутренних органов и мозга умерших людей путем интрацеребрального введения этих субстратов белым 6-дневным мышатам. Возможно культивирование возбудителя в культуре клеток. Идентификацию вируса в суспензиях мозга мышей и культуральной жидкости проводят в РТГА, РН и РСК, а в монослое культур клеток - в РИФ.

Экспресс-диагностика основана на обнаружении вирусного антигена в крови с помощью РНГА и ИФА, выявлении IgМ антител на первой неделе заболевания в ликворе и обнаружении РНК вируса в крови и цереброспинальной жидкости у людей, в клещах и внутренних органах животных с помощью ПЦР.

Обнаружение антител в парных сыворотках и цереброспинальной жидкости проводят с помощью РСК и РТГА, а также других серологических реакций.

Специфическое лечение и профилактика. Для лечения и экстренной профилактики клещевого энцефалита у непривитых лиц, подвергшихся нападению клещей в эндемичных по клещевому энцефалиту районах, а также у привитых лиц, получивших множественные укусы, применяют специфический гомологичный донорский иммуноглобулин против клещевого энцефалита, полученный из плазмы доноров, проживающих в природных очагах клещевого энцефалита и содержащий в высоком титре антитела к вирусу клещевого энцефалита. При

5

отсутствии этого препарата назначают специфический гетерологичный

лошадиный иммуноглобулин.

Профилактика включает две группы мероприятий: специфическая профилактика с помощью вакцин и иммуноглобулина, и комплекс мер по ограничению численности переносчика и предотвращения его присасывания. Для вакцинации лиц, проживающих на эндемичных по клещевому энцефалиту территориях, а также выезжающих на эти территории в весенне-летний период, используются убитые вакцины. Предусмотрено трехкратное введение вакцины: первое, через 4 недели - второе, через 11 месяцев - третье введение вакцины. Ревакцинацию проводят спустя 3 года.

После присасывания клеща рекомендовано введение специфического иммуноглобулина.

Для исключения пищевого пути заражения в природных очагах клещевого энцефалита необходимо употреблять только кипяченое молоко.

Важное значение в профилактике клещевого энцефалита отводится неспецифическим мероприятиям: соблюдение правил рационального использования лесов и пастбищ, контролируемый выпас скота, устранение вторичных очагов обитания переносчика, соблюдение защитных мер, предотвращающих нападение клещей на человека.

II. Вирус бешенства

Бешенство - вирусная зоонозная природно-очаговая инфекционная болезнь с контактным механизмом передачи возбудителя, протекающая по типу энцефаломиелита, сопровождающаяся дегенерацией нейронов головного и спинного мозга и всегда заканчивающаяся летально.

Историческая справка. Бешенство известно с глубокой древности. Первое описание клинической картины заболевания у человека принадлежит А. Цельсу (I в. н. э.), который назвал ее водобоязнью (hydrophobia) и рекомендовал прижигать укушенные раны. Распространение возбудителя в зараженном организме по нервным стволам выявлено румынским ученым В. Бабешем (1887 г.).

Штаммы вируса бешенства, циркулирующие в природе у животных, называются уличными. Они вызывают заболевания с довольно длительным инкубационным периодом и обычно образуют специфические тельца-включения в цитоплазме инфицированных клеток. Путем длительного интрацеребрального пассирования на кроликах Л. Пастеру удалось получить так называемый фиксированный вирус бешенства, который использовался в дальнейшем для приготовления вакцин. В 1885 г. Л. Пастер начал проводить антирабические прививки у человека.

Таксономия. Возбудитель бешенства включён в род Lyssavirus семейства

Rhabdoviridae.

Морфология вирионов. Вирионы вируса бешенства имеют пулевидную форму (один конец закруглен, другой – плоский). Вирионы состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки (суперкапсида), на поверхности которой имеются характерные выступы (шипы). Нуклеокапсид включает в себя РНК (геном вируса) и специфические белки. Геном

6

образует спиральная однонитевая несегментированная молекула минус-РНК. В составе вирионов присутствует РНК-зависимая РНК-полимераза.

Внутренними белками рабдовирусов являются полипептиды L, N, NS и М, наружным – гликопротеин G. Три белка (N, L, NS) являются белками нуклеокапсида (рибонуклеопротеина) и участвуют в регуляции различных процессов при репродукции вируса. Рибонуклеопротеин (РНП) состоит из геномной РНК, N-белка, укрывающего в виде чехла геномную РНК, L-белка и NS-белка. Одной из функций N-белка является то, что он предохраняет вирусную РНК от действия клеточной протеазы. L- и NS-белки являются компонентами транскриптазы. Белок М составляет внутренний слой вирусной оболочки. Гликопротеин G входит в состав наружного слоя оболочки вириона и образует на его поверхности шипы. Этот белок участвует в адсорбции и проникновении вируса в клетку.

Репродукция вирусов. Адсорбция вируса протекает путем прикрепления белка G к рецепторам чувствительной клетки. Затем вирусы проникают в клетку как путем эндоцитоза, так и в результате слияния липопротеидной оболочки вируса с плазматической мембраной клетки. В эндосомах в результате протеолиза нуклеокапсид освобождается и выходит в цитоплазму клетки. Сначала на вирионной минус-РНК синтезируются неполные и полные нити плюс-РНК. Неполные плюс-нити РНК являются индивидуальными иРНК для синтеза вирусных белков в рибосомах клетки. Полные плюс-нити РНК служат матрицей для синтеза дочерней геномной минус-РНК. Выход вирионов происходит почкованием через модифицированные участки клеточной оболочки, в которой к моменту выхода находятся вирусные белки G и М.

Устойчивость вируса. Вирус малоустойчив во внешней среде и быстро инактивируется под действием солнечного света и высокой температуры. При 56°С инактивация наступает за 15 минут, при 60°С - через 5 минут, при 80-100°С – за 1-2 минуты. Низкие температуры консервируют вирус (при 0°С сохраняется в течение нескольких недель). Дезинфицирующие средства (растворы формальдегида, едкой щелочи, хлорной извести) в обычных концентрациях действуют на вирус губительно.

Эпидемиология. Заболевание распространено повсеместно, кроме Антарктики. Ежегодно свыше 10 млн. человек получают различные повреждения от животных и более 4 млн. человек получают специфическую антирабическую помощь. Ежегодно в мире умирает от бешенства 50000 человек, в РФ – 20-25 человек. Восприимчивость к бешенству всеобщая, заболевание встречается во все времена года. Бешенство - типичный зооноз; резервуаром возбудителя могут быть практически все млекопитающие (собаки, кошки, крупный рогатый скот, летучие мыши, лисы, волки, грызуны и др.). Основной путь передачи - через укус больного животного, также возможно проникновение возбудителя через повреждённые кожные покровы при ослюнении их больным животным. В слюне животных вирус появляется за несколько дней (за 2-10 дней) до начала клинических проявлений. Возможен аэрогенный механизм передачи вируса в пещерах, населенных летучими мышами, которые многомесячно могут выделять вирус бешенства со слюной.

Выделяют два типа заболевания – дикое бешенство и городское бешенство. Источником инфекции в очагах дикого (природного) бешенства являются лисы, волки, енотовидные собаки, песцы, шакалы, грызуны, насекомоядные, плотоядные и

7

кровососущие летучие мыши. Источником инфекции в очагах городского бешенства являются собаки и кошки. Наибольшую эпидемическую опасность представляют больные собаки (до 90% всех случаев).

Патогенез поражений. Со слюной больного животного вирус попадает при укусе в поврежденные наружные покровы. В месте входных ворот в миоцитах или в эпителиальных клетках базального слоя эпидермиса происходит первичное размножение вируса. После этого вирус проникает в нервные окончания. Затем вирус мигрирует центростремительно по аксоплазме периферических нервов в центральную нервную систему, где размножается в нейронах дорсальных ганглиев спинного, а затем и головного мозга, вызывая дегенерацию нейронов. В центральной нервной системе вирус накапливается в нейронах гиппокампа, ядер моста, мозжечка, лимбической системы и обонятельных луковиц. В цитоплазме нейронов мозга обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. Клетки претерпевают дистрофические, воспалительные и дегенеративные изменения.

Затем вирус диссеминирует тем же путем, но в обратном направлении по центробежным нейронам по всему организму в различные ткани (включая слюнные железы). В связи с богатой иннервацией слюнных желез титр вируса в слюне намного превышает его содержание в мозговой ткани. В крови вирус не обнаружен.

Клинические проявления. Различают следующие периоды заболевания: инкубационный период, продромальный период (стадию депрессии), период развившейся болезни (стадию возбуждения), период параличей.

Инкубационный период у человека при бешенстве - от 6 дней до 3 месяцев, иногда до года и более, что зависит от характера и локализации повреждения. Короткий инкубационный период отмечается при множественных укусах в голову, более продолжительный - при укусах в конечности.

Продромальный период характеризуется раздражительностью, бессонницей, нарушением чувствительности в области раны, недомоганием, страхом, беспокойством, тревогой. Первые признаки болезни обнаруживаются в месте укуса: тянущие, ноющие боли, зуд, невралгические боли по ходу нервных стволов. Рубец на месте укуса иногда слегка воспаляется и становится болезненным. Отмечаются субфебрильная температура, головная боль. Может беспокоить сухость во рту. Аппетит снижен, язык обложен.

Период развившейся болезни (стадия возбуждения) характеризуется затруднением глотания (сначала жидкой, а затем и твёрдой пищи), генерализованными судорогами, делирием и комой. Развиваются рефлекторная возбудимость, спазматические сокращения мышц глотки и гортани; дыхание шумное, судорожное. Присоединяются слуховые и зрительные галлюцинации. Судороги усиливаются при попытке пить, при виде льющейся воды (гидрофобия), от дуновения (аэрофобия), яркого света (фотофобия), шума (акустофобия) и при других воздействиях. Первый клинически выраженный приступ болезни (“пароксизм бешенства”) чаще развивается внезапно под влиянием какого-либо раздражителя. Приступ характеризуется внезапным вздрагиванием всего тела, руки вытягиваются вперед и дрожат, голова и туловище отклоняются назад. Приступ длится несколько секунд. Часто наблюдаются икота и рвота. Во рту скапливается густая и вязкая слюна, выделяется липкий пот, отмечается тахикардия. Приступы следуют один за другим. После окончания приступа больные приходят в состояние

8

относительного покоя. Явления беспокойства могут принимать агрессивный характер и даже перейти в состояние буйства.

Период параличей. Состояние улучшается. Дыхание становится более свободным. Приступы гидрофобии и аэрофобии прекращаются. Больные могут пить и есть. Исчезают страх и возбуждение. Появляется надежда на выздоровление. “Успокоение” продолжается 1-3 дня. Одновременно наступают вялость, апатия, гипертермия. Ухудшается сердечнососудистая деятельность, появляются параличи мышц конечностей и черепно-мозговых нервов, дисфункции тазовых органов. Смерть наступает через 5-7 дней от начала болезни от паралича дыхательного и сосудистого центров.

Микробиологическая диагностика. Материал для исследования - слюна,

кровь и секционный материал (ткани мозга и подчелюстных слюнных желёз). Для выделения и идентификации возбудителя применяют следующие методы:

-вирусоскопические исследования;

-биологические исследования;

-серологические методы.

Вирусоскопическое исследование. С помощью микроскопии окрашенных срезов или отпечатков выявляют в клетках коры полушарий, аммонова рога и мозжечка эозинофилъные тельца Бабеша-Негри. Срезы и отпечатки также используют для обнаружения антигенов вируса в этих тканях с помощью РИФ или РНИФ.

Биологическое исследование. При отрицательных результатах экспрессметода ставят биопробу. Возбудитель выделяют путём внутримозгового заражения мышат и кроликов слюной больных людей или свежим секционным материалом. У животных развиваются параличи с летальным исходом, и в тканях мозга можно обнаружить тельца включений и антигены вируса в РИФ и РНИФ.

Метод флуоресцирующих антител (МФА) позволяет выявлять до 98%

инфицированных образцов. МФА основан на микроскопическом исследовании в ультрафиолетовых лучах отпечатков, мазков и криоконсервированных срезов тканей, обработанных антирабическим глобулином, конъюгированным с флуоресцеин изотиоционатом.

В последнее время разработана полимеразная цепная реакция (ПЦР). Вирус можно выявить в слюне, мазках-отпечатках с конъюнктивы глаза, кожных биоптатах или определить его присутствие в цереброспинальной жидкости, слюне, слезной жидкости.

Лечение. Больного бешенством обязательно помещают в отдельную палату и защищают от любых внешних раздражителей. Первоначально раны или укусы обрабатывают антисептиками; места ослюнения обмывают мыльным раствором. Назначают симптоматическое и патогенетическое лечение: снижение возбудимости нервной системы, поддержание водно-электролитного баланса, дезинтоксикация, витаминотерапия. Затем проводят специфическую иммунопрофилактику. Методов терапии бешенства не существует. При появлении клинических симптомов спасти больных не удаётся. Прогноз при развившейся болезни неблагоприятный, достоверных случаев выздоровления нет.

Профилактика. Проводят специфическую иммунопрофилактику

антирабической вакциной и антирабическим иммуноглобулином. Лицам,

9

получившим множественные укусы или повреждения опасной локализации, предварительно вводят антирабический иммуноглобулин, а затем проводят курс вакцинации. Антитела после прививок появляются лишь через 3 недели. При ранениях неопасной локализации проводят только вакцинацию. Иммунитет сохраняется на протяжении года.

Внастоящее время вакцины, изготовленные из ослабленного или убитого вируса, выращенного на нервных клетках in vivo, вытесняют культуральные вакцины из ослабленного вируса, полученные на линиях различных клеток. В плановом порядке вакцину вводят в 1-е, 3-и, 7-е, 14-е и 28-е сутки. Профилактика бешенства включает также контроль над заболеванием в природе и вакцинопрофилактику животных.

Обязательную вакцинопрофилактику проводят в группах повышенного риска - звероловам, ветеринарам и др.

Внашей стране для профилактики бешенства у людей используются две вакцины: вакцину антирабическую культуральную очищенную инактивированную сухую Рабивак-Внуково-32 (КАВ) и вакцину антирабическую культуральную инактивированную концентрированную очищенную сухую (КОКАВ). Обе эти

сыворотки человека, который поставляется из плазмы доноров, вакцинированных антирабической вакциной, а также антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади жидкий.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

Постановка РТГА с парными сыворотками крови больного клещевым энцефалитом. Готовят разведения первой и второй сывороток от 1:10 до 1:320 на боратном буферном растворе, рН 9,0 в объеме 0,05 мл (1 капля). К полученным разведениям добавить по 1 капле рабочего разведения диагностикума вируса клещевого энцефалита (8 ГАЕ). В контрольную лунку вносят 2 капли боратного буферного раствора. Затем во все лунки прибавляют по 2 капли 0,5%-ной взвеси гусиных эритроцитов. Результаты реакции учитывают после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках.

7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки темы:

8.1.Основная:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов

10

учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям

060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт.

дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

8.2.Дополнительная:

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.