Ожешко әдісімен спораларды бояу

Бояу кезеңдері:

1.Бекітілмеген (фиксацияланбаған) жұғын-препаратқа 0,5% хлор қышқылы тамшысын тамызады да оттың үстінде бу шыққанға дейін қыздырады (2- 3 мин);

2.Қышқылды төгіп, сумен шайып, кептіру керек;

3.Оттықтың үстінде бекітеді;

4.Циль-Нельсен әдісімен бояу (споралар – қызыл түсте, ал вегетативті формалары – сия көк түсте). Толық жетілген спора бояуды өте қиын қабылдайды, себебі қабықшасы еш нәрсе өткізбейді. Грам әдісімен бояғанда спора түзуші дақыл бояуды тек микробтық жасушаның вегетативтік бөлігі боялады, ал спора түссіз. Оның қабығының өткізгіштігі ыстық тұз қышқылымен өңдегеннен кейін немесе қыздырумен жүретін бояудың концентрирленген ерітіндісін қолданған кезде бірден жоғарылайды. Бояуды қабылдаған спора қышқылмен қайта өңдеу барысында, вегетативті жасушалар бірден бояуын жоғалтқан кезде түссізденбейді.

Спораларды бояу

Бактериялардың кейбір түрлері жасуша ішілік (эндогенді) споралар түзеді. Вегетативті жасушалардан ерекшелігі оларда бос судың мөлшері аз болады, сонымен бірге липидтер мен кальцидің құрамы жоғары болады.

Бактерияларда капсуланы анықтау

Кейбір микробтарда өзінің денесінің беткейінде жасушалық қабырғасының айналасында көлемді шырышты қабатты өндіретін қасиеті бар, оны капсула деп атайды. Капсуланың құрамына ең бастысы полисахсридтер (пневмококк) кіреді, бірақ кейбіреулерінің құрамында полипептидтер болады (сібір түйнемесі таяқшасы). Капсулалардың консистенциясы гель тәрізді, соған байланысты тірі бактериялардың микроскопиясы кезінде олар нашар көрінеді. Оларды анықтау үшін негативті бояуды қолданады. Барлық айтылған әдістер позитивтіге жатады, өйткені оларды қолданған кезде микробты жасушалар боялады. Негативті әдістерде бояғыш бактерия айналасындағы кеңістікті толтырады, нәтижесінде олар қара фонда ашық бөлшектер болып көрінеді.

Бурри әдісі бойынша капсуланы анықтау

Әдістемесі:

Затттық шынының шетіне тушь тамшысын және ілмекпен зерттелетін материалды аламыз. Ерітіндіні жақсылап ілмекпен араластырып, жұғын дайындаймыз, қаннан жасалған жұғын тәрізді, кептіреміз, бекітпейміз, иммерсионды жүйеде микроскопиялаймыз. Жұғын қара микроб денесі және олардың капсулалары тушпен боялмайды, түссіз болып қалады, сондықтан бұл тәсіл негативті деген атқа ие болған.

Гинс әдісі бойынша капсуланы анықтау

Әдістемесі:

1.Бурри әдісімен негативті боялған препаратты дайындау.

2.Кез-келген химиялық әдіспен бекіту: метил спирті, Никифиров қоспасы немесе басқа да қоспалармен.

3.Сумен шаю.

4.1:3 қатынасында араластырылған, карбол фуксинімен 3-5 мин. бояймыз.

5.Сумен шайып, кептіріп және иммерсионды жүйемен микроскопиялау.

Микроскопия кезінде қара фонда препаратта боялмаған капсулалар айқын көрінеді, оның ортасында бактериялар ашық қызыл түсте болады.

Хаттама толтыру кесте үлгісі:

Хаттама №___ Күні:____________

Тақырыбы: ____________________________________________________

Зерттеу материалы: (тексерілетін материалды көрсету, қолданатын бактерия дақылы және т.б.).

Зерттеу жолы: (этаптары бойынша көрсету, зерттеу этаптарын альбомға түсіру)

Қорытынды нәтижесі: (микроскоптан қараған суретті салу, иммунологиялық реакцияларды, бөліп алынған дақылдың биологиялық қасиеттерін көрстеу, сурет салу).

Қорытынды

Тақырыбы: Қышқылға төзімді бактериялар және оларды Циль-Нильсен әдісімен бояу. Тірі бактерияларды зерттеу. Спирохеттердің, актиномицеттердің, риккетсиялардың, микоплазмалардың, саңырауқұлақтардың, вирустардың морфологиясы. Фазалы-контрасты, люминесцентті және электронды микроскоппен жұмыс істеу ережелері.

Сабақтың мақсаты: ҚР DOTS стратегиясы бойынша туберкулездің басты диагностикалық әдісі болып микроскопиялық әдіс болып саналады. ( Циль-Нильсен әдісі бойынша қақырықты бояу). Бактерияларды тірі күйінде зерттеу микроорганимздердің қозғалғыштығын, яғни талшықтарын анықтайды.

Студент білуге тиіс:

• Микобактериялардың жасуша құрылымының химиялық құрамы

• Бактерияларды тірі күйінде зерттеу әдістемесі.

• Спирохеттердің, актиномицеттердің, риккетсиялардың, микоплазмалардың, саңырауқұлақтардың, вирустардың морфологиясы.

• Қышқылға төзімді бакетряларды зерттеу әдісі .

Керекті құрал-жабдықтар: дақылдық қоспалар, бояулар жиынтығы, демонстрациялық препараттар

Сабақ тақырыбын өз бетімен дайындауға арналған сұрақтар:

1. Қышқылға төзімді бактериялардың жасуша қабырғасының құрылысы. Химиялық құрамы.

2. Циль-Нильсен әдісінің негізі. Қолданылатын реактивтері мен бояулары.

3. Бактерияларды тірі күйінде тексеру әдістері ("езілген тамшы" және "ілінген тамшы" препараттары).

4. Спирохеталардың жіктелуі, морфологиялық ерекшеліктері. Романовский-Гимзе әдісі бойынша бояу.

5. Риккетсиялардың жіктелуі, морфологиялық ерекшеліктері. Здродовский әдісі бойынша бояу.

6. Микоплазмалардың жіктелуі, морфологиялық және тинкториалдық ерекшеліктері.

7. Саңырауқұлақтар морфологиясы. Мицелий түрлері. Құрылыстық ерекшеліктері.

8. Вирустардың жалпы морфологиялық сипаттамасы.

Тарату материалы

Қышқылға төзімді бактерияларға патогенді микобактериялар жатады: олардың ішінде туберкулез, алапес қоздырғыштары жатады. Аэробты грам теріс таяқша тәрізді қозғалмайтын бактериялар. Олардың қышқылға төзімділігі жасуша қабырғасының 60-қа жуық пайызы липидтердің, фосфолипидтердің және май балауызды заттардың құрамының жоғары болуына байланысты спиртке, сілтіге, қышқылға төзімді болып келеді.

Патогенділігіне байланысты: патогенді (нақты аурулар тудыруы), потенциальді патогенді және сапрофиттік микобактериялар деп жіктелінеді.

Өсу жылдамдығы бойынша: Тез өсетіндер 4-7 тәулікте, баяу өсетіндер 7-10 тәулікте және жасанды қоректік ортада өспейтіндер (M. Leprae) болып бөлінеді.

Пигмент түзу қабілетіне қарай: фотохромогенді (жарықта пигмент түзетіндер), скотохромогенді (қараңғыда пигмент түзетіндер) және фотохромогенді емес (пигмент түзбейтіндер) болып жіктеледі.

Қышқылға төзімді бактерияларды анықтау үшін Циль-Нильсен әдісін қолданамыз.

Спирохеталардың морфологиялық сипаттамасы.

Спирохеталар (Speira – иілген /изгиб/, chaite - шаш) – спиральға ұқсас иілген, өте жіңішке (шаш сияқты) қозғалғыш бактериялар, ұзындығы 0,1-3,0 х 5-250мкм; бір жасушалы. Жасушалар протоплазмалық цилиндр секілді фибриллалармен оралған, қозғалғыш, спора түзбейді, грам теріс, жасуша ішілік қосындылар бар. Кейбір спирохеталар анилинді бояулармен нашар боялады. Спирохе­талар туыстастықтарын санына және жіпшелердің орамдарына, аяқтамаларына байланысты жіктейді.

Актиномицеттердің морфологиялық сипаттамасы. (ескі жіктелуі бойынша сәулелі саңырауқұлақтар). Актиномицеттердің саңырауқұлақтардан айырмашылығы жасуша құрылысы прокариоттық, жасуша қабырғасында хитин немесе целлюлозасы болмайды Тек жыныссыз жолмен көбейеді. Актиномицеттердің мицелийі субстратты және ауалы болып екіге бөлінеді. Мицелиальді бактерияларға микобактерияларды, нокардия және актиномицеттер туыстастықтарын, бірнеше жоғары актиномицеттер туыстастықтарын жатқызамыз.

Риккетсиялардың морфологиялық сипаттамасы. Риккетсиялар ұсақ полиморфты грам теріс бактериялар. Олардың жасуша қабырғасы екі қабатты қабықшадан, цитоплазмадан, нуклеоидтан тұрады. Риккетсиялар пішіндері бойынша таяқшалы, жіпшелі және конус тәрізді болады. Барлық риккетсиялар жасуша ішілік паразит болып табылады, сондықтан олар тек тірі ағзада ғана көбейе алады. Олар бөртпелі сүзек және әртүрлі қызбалық инфекциялық ауруларды тудырады. Тасымалдаушылары болып: кенелер, биттер, бүргелер табылады. Осылардың ағзаларында риккетсиялар көбейеді.

Микоплазмалардың морфологиялық сипаттамасы. Микоплазмалар табиғатта кеңінен таралған ұсақ племорфты грам теріс микроорганизмдер, басқа бактериялардан айырмашылығы жасуша қабырғасы жоқ, бірақ үш қабатты липопротеидті цитоплазматикалық мембранадан тұрады. Микоплазмалар пішіні бойынша шар, сопақша, жіпшелі, жұлдыз тәрізді болады. Микоплазмаларды Берджи жіктелуі бойынша Tenericutes бөліміне жатқызады. Олардың өлшемдері әртүрлі: бірнеше микрометрден 125-150-ге нм дейін. Микоплазмалар топырақта, ағынды суларда, әртүрлі субстраттарда табылған. Адам және жануарлар ағзасында патогенді және шартты-патогенді түрлері кездеседі. Патогенді микоплазмалар тыныс алу жолдарын, зәр шығару және ОЖЖ зақымдайды. Адам үшін патогенді Mycoplasma pneumonia, ал шартты-патогенді - Mycoplasma hominis болып табылады.

Саңырауқұлақтардың морфологиялық сипаттамасы.

Саңырауқұлақтар Fungi әлеміне (Mycetes Mycota) жатады.Олар көпжасушалы немесе бір жасушалы, жасуша қабығы бар хлорофильсіз микроорганизмдер. Эукариоттар яғни «Eucarya» доменіне жатады. Табиғатта, әсіресе топырақта кең таралған. Саңырауқұлақтардың ядролық қабығы, ядро, цитоплазма, органеллалар, цитоплазмалық мембрана және бірнеше типті полисахаридтер (маннан, глюкан, целлюлоза, хитин), ақуыз, липидтен және т.б. құралған көпқабатты, ригидті жасуша қабығы бар. Кейбір саңырауқұлақтар капсула түзеді. Саңырауқұлатар грам оң микробтар, вегетативті жасушалары қышқылға төзімсіз, саңырауқұлақ денесі-талломом деп аталады. Ащытқы саңырауқұлақтар жеке сопақшалы торшалар түзеді. Көгерткіш саңырауқұлақтар құрылысы жасушалық жіпше тәрізді - гифтер. Мицелий- гифтердің шоғырлануы - басты морфологиялық құрылысы Саңырауқұлақтар жынысты және жыныссыз жолмен көбейеді. Вегетативті көбею барысында мамандандырылған репродуктивті құрылысы - споралар- конидии түзеді. Медициналық маңызы бар көптеген саңырауқұлақтардың түрлері үшін конидиялардың болуы ( немесе экзоспора), жыныссыз жолмен көбею түрі. Олардың жиі кездесетін түрлері- бластопоралар, хламидоспоралар, артроспоралар, конидиоспоралар.

Вирустардың морфологиялық сипаттамасы.

Вирустар – тұқым қуалаушылық қасиеті бар, өзгеруге, көбеюге бейім өте ұсақ, тірі микроорганизмдер. Вирустардың бактериялардан айырмашылығы – жасушалық құрылысы болмайды, тек қана бір нуклеин қышқылы – ДНҚ немесе РНҚ болады. Жасуша ішінде генетикалық дәрежедегі паразиттер болып саналады. Ақуыз синтездейтін рибосомалары болмайды, сондықтанда оларда зат алмасу жүрмейді. Вирус құрылысының компоненттері: капсомер-ақуызды бөлек бірлігі, капсид-капсомерлерден құралған, нуклеокапсид – нуклеин қышқылы мен капсид ақуызының кешені, вирион – вирустың бүтін бөлшегі. Вирустардың құрамы өте қарапайым. Олар нуклеин қышқылынан және оларды қоршап жататын – капсид және суперкапсид деп аталатын қабаттардан, сондай-ақ вирус қабығының сыртындағы рецепторлардан (синонимі – бекітуші ақуыздар, тікенектер) құралады. Аздаған ферменттер болады, олардың біреулері вирус нуклеин қышқылдарының репликациясына және вирус ақуыздарының транскрипциясына қажет, ал басқалары – жасушаның ішіндегі метоболиттік процесстерді өзгертіп немесе тежей отырып, зат алмасу процесстерінің вирустардың бөлшектерін құрастыру үшін жұмыс істейді.

Вирустарды жіктеуде мынадай қасиеттері мен негізгі белгілері ескеріледі:нуклеин қышқылының типі, нуклеин қышқылының молекуласындағы шынжыр тізбек саны, вирионның мөлшері мен саны,әрі симметриялық типі, сыртқы қосымша капсидінің болу-болмауы,негізгі өсіп-өніп, көбейетін жері т.б.

Морфологиялық құрылысы бойынша вирустар 2 топқа бөлінеді:

1.жай, қарапайым құрылысы – нуклеин қышқылы және оны қоршаған капсидтен тұрады (полиомиелит вирусы, аденовирустар, құтыру вирусы)

2.күрделі құрылысты – нуклеин қышқылынан, капсид және суперкапсидтен тұрады.

Зертханалық жұмысты орындау түрі

Тақырып бойынша сұрақтар:

1.Дайын жұғын-препаратты Циль-Нельсен әдісімен бояу (қақырықтан алып)

2. Жұғын-препаратты микроскопиялау.

3. Нативті және боялған препараттарды « езілген» немесе « ілінулі» тамшы әдістерін қолдана отырып үйрену.

4.Хаттама толтыру

Қышқылға төзімді бактерияларды бояу

Қышқылға төзімді микроорганизмдер бейорганикалық қышқылдарға, спиртке, сілтіге айтарлықтай тұрақтылық байқатады. Олардың осындай қасиеті жасуша қабырғасында және цитоплазмасында липидтердің көп болуымен (май балауызды заттар) байланысты. Микобактериялар қарапайым бояуларды дұрыс қабылдамайды, сондықтан жылытылған концентрирленген бояулар ертінділері қолданалады. Бояу барысында микробтық жасушаларды қышқылмен өңдегенде, олар алғашқы бояуын жоймайды. Осы қасиеті бойынша басқа қышқылға тұрақсыз бактериялардан ажыратуға болады. Қышқылға төзімді бактерияларды Циль-Нельсен әдісімен бояйды .

Циль-Нельсен әдісімен бояу

Әдістемесі:

1. бекітілген жұғын-препаратқа карбол фуксинінің бірнеше тамшысын тамызады, сүзгі қағазбен жауып бу шыққанға дейін қыздырады, тағы 1-2 рет бояу тамызып қыздырады (3-5 мин);

2. сүзгі қағазын алып тастап, жұғын-препаратты салқындатады, 5% күкірт қышқылы ертіндісі немесе 3% тұз қышқылды спиртпен 2-4 с.) түссіздендіреді;

3. жақсылап сумен шаяды

4. Леффлер сия көгімен бояу (3-5 мин); сумен жақсылап шайып, кептіру керек

Қышқылға төзімді бактериялар рубинді-қызыл түске, ал қышқылға төзімдіемес бактериялар – сия көк түске боялады.

Микроорганизмдерді тірі күйінде зерттеу

Микроорганизмдерді тірі күйінде олардың пішінін, қозғалғыштығын немесе тірі күйіндегі ішкі құрылысын анықтау үшін зерттейді. «Езілген тамшы» немесе «ілінген тамшы» әдісін қолдана отырып нативті және боялған препараттарды зерттеуге болады.

Тірі күйінде (витальді) бояу.

0,001% метилен көгінің немесе бейтарап қызылдың ерітіндісінің тамшысына микроорганизмдердің қоспасын енгіземіз. Содан соң «езілген» немесе «ілінген» тамшы препаратын дайындаймыз және микроскопиялаймыз.

«Езілген тамшы» препаратын дайындау: Майсыздандырылған заттық шынының ортасына сұйық сорпа дақылының 1 тамшысын тамызамыз. Егерде дақыл тығыз қоректік ортада өсірілген болса, онда 1тамшы стерильді натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісін тамызып, сосын ілмекпен дақылдан алып, ілінген бактерияны тамшымен араластырамыз. Немесе изотоникалық ерітіндіде микроорганизмдер қоспасын дайындап,содан 1 тамшы алуға болады. Зерттелетін материалға жабын шыныны жабамыз, ауа тамшыларын қалдырмай. Тамшы алғанда оның көлемі заттық шыны мен жабын шынының ортасын ғана толтырып, жиегінен аспауы керек. Препаратты құрғақ жүйемен де иммерсиондық жүйемен де көруге болады. 40х және 90х объективті қолдана отырып, микроскоптайды. Қараңғы аймақтық немесе фазалы – контрасты құрылымдарды қолдану арқылы өте жақсы нәтижелерді алады. Препараттар жылдам кеуіп кетеді, егер оларды біршама уақыттан кейін қарайтын болса, онда оны ылғал камераға (Петри ыдысына ) түбіне 2-3 ылғал дөңгелек сүзгіі қағазы, оның бетін екі құрғақ қағазбен жауып орналастырамыз. Препарат кеуіп кетпес үшін және сұйықтықтың турбулентті қозғалысының конвекциясын тудырмас үшін оны герметизациялауға болады. Бұл мақсатта парафин майын, парафин мен вазелиннің тең көлемін немесе тырнаққа арналған лакты қолдануға болады. Қозғалғыш микроорганизмдер кейде шыныға жабыспайды, сондықтан қозғалғыштықты «ілінген тамшыда» оңай көруге болады.

«Ілінген тамшы» препаратын дайындау: Заттық шыныға зерттелетін материалдың аз мөлшерін тамызып, ойшығы бар заттық шынының ойшығының айналасына алдын ала вазелин майы жағып алады да,заттық шыныны төңкеріп жабады, сол кезде екі шыны беттесіп жабысады. Герметикалық жабылған камера пйда болып,тамшы ұзақ уақыт кеуіп кетпей сақталады.Алғашында препараттағы тамшының жиектерін кішкентай үлкейткішпен, қысылған диафрагмамен тауып қарап, кейіннен неғұрлым күшті құрғақ жүйенің көмегімен зерттейді.Көптеген қозғалғыш микроорганизмдер жылдам қозғалады да зерттеуге қиындық туызады. Суспензияға метилцеллюлоза қосу арқылы олардың қозғалысын баяулатып, олардың қозғалысын көретіндей жағдай жасауға болады.

Хаттама толтыру кесте үлгісі:

Хаттама №___ Күні:____________

Тақырыбы: ____________________________________________________

Зерттеу материалы: (тексерілетін материалды көрсету, қолданатын бактерия дақылы және т.б.).

Зерттеу жолы: (кезеңдері бойынша көрсету, зерттеу кезеңдерін альбомға түсіру)

Қорытынды нәтижесі: (микроскоптан қараған суретті салу, иммунологиялық реакцияларды, бөліп алынған дақылдың биологиялық қасиеттерін көрстеу, сурет салу).

Қорытынды

Тақырыбы: Бактериологиялық әдіспен зерттеу жобасы. Аэробты микробтардың таза дақылын бөліп алу (зерттеудің 1-ші күні)

Бактериялар физиологиясы - бактериялардың тіршілігін, зат алмасуын, қоректенуін және қоршаған ортамен қарым қатынасын зерттейді. Бактериялардың зат алмасуын зерттеу, оларды дақылдандыруда, таза дақылдарын бөліп алып идентификациялауда үлкен орын алады. Патогенді және шартты – патогенді бактериялардың физиологиясын зерделеу, олар тудыратын жұқпалы аурулардың патогенезін зерттеу, микробиологиялық диагноз қою, емдеу және олардың алдын алу, адам мен қоршаған орта қарым қатынастарын реттеу, сонымен қатар биотехнологиялық процестерді қолдана отырып, бактериялардан биологиялық белсенді заттарды алу үшін қажет.

Таза дақыл – бактерияның бір түрінің популяциясының қоректік ортада көбеюін айтады.