Глава 2 материал и методы исследований

Таблица 3 – Протокол изопропиловой проводки почек

№ станции	Реагент	Экспозиция
1	50%-ный водный раствор Isoprep (смесь Isoprep-вода 1:1)	1 час.
2	Isoprep	30 мин.
3	Isoprep	30 мин.
4	Isoprep	30 мин.
5	Isoprep	1 час.
6	Isoprep	1 час.
7	Isoprep	2 час.
8	Isoprep	3 час.
9	Isoprep	3 час.
10	Histomix/ Histomix Extra	1 час.
11	Histomix/ Histomix Extra	3 час.
12	Histomix/ Histomix Extra	4 час.
Итого			20 час. 30 мин.

На ротационном полуавтоматическом микротоме SLEE CUT 5062 (Германия) изготавливали серийные срезы толщиной 3-7 мкм, монтировали их на предметные стекла смесью белка и глицерина в пропорции 1:1. Срезы окрашивали по трем методикам. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Суммарные кислые гликозаминогликаны (ГАГ) выявляли реакцией по методу Стидмена. Распределение коллагена в тканях мозга определяли по методу Маллори. Изучение общей морфологической картины осуществляли на обзорных препаратах, окрашенных гематоксилином Бёмера и эозином по следующей методике:

а) Депарафинирование срезов

1. Ксилол I – 2 минуты

2. Ксилол II – 2 минуты

3. Ксилол III – 2 минуты

б) Обезвоживание срезов

1. Спирт 96⁰ – 1 минута

2. Спирт 96⁰- 1 минута

3. Спирт 70⁰ – 1 минута

в) Промывка в воде

г) Окрашивание гематоксилином Бёмера – 2 минуты

д) Промывка в проточной воде – 2 минуты

е) Окрашивание эозином – 1 минута

ж) Обезвоживание срезов

1. Спирт 70⁰- 1 минута

2. Спирт 96⁰ – 1 минута

3. Спирт 100⁰ – 1 минута

и) Просветление срезов в карбол - ксилоле (1:1) – 1 минута

к) Ксилол I – 1 минута

л) Ксилол II –1 минута

м) Заключение срезов в канадский бальзам под покровное стекло.

Результат: нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) окрашиваются в фиолетовый цвет (базофильно); белки цитоплазмы – в розовый цвет (оксифильно).

Реакция на кислые гликозаминогликаны (гаг) с альциановым синим

а) Альциановый синий – 10 минут

б) Дистиллированная вода

в) Гематоксилин Майера – 2 минут

г) Дистиллированная вода

д) Обезвоживание срезов:

1. Спирт 70⁰ – 1 минута

2. Спирт 96⁰ – 1 минута

3. Спирт 96⁰ – 1 минута

е) Ксилол I, II – по 2 - 3 минуты.

ж) Заключение срезов в канадский бальзам под покровное стекло.

Результат: кислые гаг окрашиваются в голубой цвет. Реакция на коллаген по Маллори

а) Депарафинирование и обезвоживание срезов

б) Окрашивание 0,1% раствором кислого фуксина – 2-3 минуты

в) Промыть срезы в дистиллированной воде – 1-2 минуты

г) Окисление срезов в 1% растворе фосфорномолибденовой кислоты – 4 минуты

д) Промыть срезы в дистиллированной воде – 2 минуты

е) Окрашивание раствором Маллори – 2 минуты

ж) Промыть срезы в дистиллированной воде – 2-3 минуты

и) Обезводить срезы в абсолютном спирте – 3-5 минут

к) Ксилол I, II – по 2-3 минуты

л) Заключить срезы в БиоМаунт под покровное стекло.

Результат: коллагеновые и ретикулиновые волокна окрашиваются в темно-синий цвет, слизь в синий цвет, эритроциты в красновато-оранжевый цвет, секреторные гранулы в красный цвет [48].

Препараты изучали с помощью микроскопа CARL ZEISS Axio Imager M2 (Германия).

Статистическую обработку данных проводили на основе вычисления средних арифметических (х) и их ошибок (Sx). Различия показателей животных экспериментальной группы по сравнению с таковыми контрольных животных оценивали методом вариационной статистики по т-критерию Стьюдента и считали достоверными при р≤0,05 и p≤0,01. Все расчеты проводили по общепринятым формулам с использованием пакета программ Microsoft Excel 2010.