Автоматизированнный метод с использованием автоматических микробиологических анализаторов

Характеристика метода.

Рис. 47. Карта с лунками, заполненными

дегратированными антибиотиками,

углеводами, индикаторами рН

Количественный. Определяет активные препараты и их ингибирующие концентрации, прогнозирует механизмы устойчивости, позволяет создавать компьютерную базу резистентности всех исследованных культур к антиботикам.

Особенности метода. Используют стандартные тест-системы, в которых антибиотики в трех концентрациях внесены в специальные лунки пластиковой тест-системы. В лунках также находятся углеводы и индикатор рН. Все субстраты в лунках высушены.

Техника проведения. Готовят суспензию чистой культуры тест-микроорганизмов с мутностью 0,250,65 по стандарту McFarland. Прибор вносит автоматически суспензию микроорганизмов в тест-систему, инкубирует при 35⁰С в течение суток, учитывает каждые 2 часа результаты, по мере готовности результатов интерпретирует их в течение 2–24 часов, выдает протокол результатов (электронный, печатный).

Принцип метода. Если концентрация антибиотика не активна, микроорганизмы растут и размножаются, вызывая увеличение мутности среды, снижение рН среды и изменение цвета индикатора. Если концентрация антибиотика активна, то микроорганизмы не изменяют мутность и цвет среды (рис. 47).

Оценка чувствительности. Прибор автоматически проводит нефелометрию и спектрофотометрию и по изменению мутности и цвета среды определяет МИК тест-культуры. Сравнивает ее со стандартными величинами МИК и относит тест-культуру к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным штаммам.

Оценка метода. Стандартный, из-за автоматизации прост в исполнении, позволяет получать результаты через 5–8 часов, позволяет создавать электронную базу данных и сравнивать данные из различных лабораторий. Требует дорогостоящего автоматического анализатора.

Генетические методы

Характеристика методов. Определяют генетические маркеры резистентности.

Особенности методов. Используют ПЦР, ПЦРПДРФ, ДНК-гибридизацию, секвенирование.

Техника проведения. Выделяют ДНК из материала от больных или из чистой культуры микроорганизмов. Проводят генетические исследования. Проводят сравнение с данными фенотипического анализа.

Принцип методов. У резистентных микроорганизмов присутствуют гены, контролирующие синтез ферментов, разрушающих антибиотики. У некоторых микроорганизмов резистентность связана с мутациями в генах, кодирующих структуры, на которые действует антибиотик. Изменение мишени приводит к резистентности (рис. 48).

Оценка чувствительности. Выявление у микроорганизма генетических маркеров резистентности свидетельствует о потенциальной устойчивости к антибиотику.

Оценка методов. Перспективны. На практике используются для диагностики антибиотикорезистентности микобактерий туберкулеза, а также для изучения генетических механизмов устойчивости в рамках регионального или национального мониторинга антибиотикорезистентности.

Рис. 48. Hain тест (реакция гибридизации на мембранах) для определения устойчивости к противотуберкулезным препаратам Mycobacterium spp. (на каждой тест-полоске верхние три горизонтальны полосы являются контролем, остальные свидетельствуют о видовой принадлежности и наличии мутаций в rpoB гене, обуславливающих устойчивость к рифампицину)

Выявление генетических маркёров резистентности целесообразно в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы определения чувствительности микроорганизмов неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулёзным препаратам с помощью культуральных методов занимает 48 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов.

Факторы, влияющие на результаты определения антибиотикорезистентности:

1. состав питательной среды:

 содержание ионов Са²⁺ (не более 2025 мг/л) и Mg²⁺ (не более 1012,5 мг/л). Эти ионы инактивируют некоторые антибиотики (тетрациклины), при этом МИК антибиотика повышается;

 содержание тимина, тимидина, инактивирующих сульфаниламиды и триметоприм,

 рН среды (рис. 49).

Рис. 49.Влияние рН среды на диметры зон задержки роста некоторых антибиотиков

2. величина посевной дозы и состояние тест-микроорганизмов (инокулюм-эффект):

 культуры, длительное время хранившиеся на плотных или жидких питательных средах, обладают пониженными ростовыми свойствами, поэтому для оценки чувствительности необходимо использовать микроорганизмы, инкубировавшиеся не более 1618 часов;

 увеличение концентрации инокулята с 10⁵ КОЕ/мл до 10⁷ КОЕ/мл может приводить к повышению МПК;

3. условия инкубации:

 изменение температуры инкубации может привести к торможению либо к увеличению скорости роста, поэтому посевы инкубируют при 35⁰С;

 преждевременный или поздний учет результатов может привести к ошибочной оценке результатов, поэтому учёт проводят через 1824 часа инкубации.

Причины несовпадений результатов определения активности препарата in vitro и его клинической эффективностью в лечении пациентов:

1. отсутствие адекватного хирургического лечения;

2. общее состояние пациента (возраст, питание, сопутствующие заболевания);

3. несвоевременное назначение антимикробной терапии;

4. низкая биодоступность препарата;

5. невозможность достижения бактерицидной концентрации в воспалительном очаге;

6. инактивация микробными ферментами.