- •Методы исследования
- •Методы исследования в микробиологии
- •Список сокращений
- •Техника безопасности при работе с биологическим материалом
- •Характеристика уровней биобезопасности
- •Забор, хранение и транспортировка материала для микробиологического исследования
- •Микроскопический (бактериоскопический)
- •Сложные методы окраски клеточных структур бактерий
- •Сравнение электронного и светового микроскопов
- •4 Этап бсми. Заключение.
- •Культивирование микроорганизмов на питательных средах
- •Классификации питательных сред
- •I. По происхождению:
- •II. По составу:
- •III. По консистенции:
- •IV. По назначению:
- •Наиболее часто используемые индикаторы рН в питательных средах
- •Признаки колоний микроорганизмов
- •Методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
- •I. Методы механического разобщения бактерий.
- •Методы выделения чистых культур облигатно-анаэробных микроорганизмов
- •Культуральный (бактериологический) метод исследования
- •I. Этапы блми при выделении чистой культуры аэробов и факультативных анаэробов.
- •1 Этап.
- •2 Этап.
- •3 Этап.
- •Признаки, учитываемые при идентификации микроорганизмов (критерии вида)
- •4 Этап.
- •II. Этапы блми при выделении чистой культуры облигатных анаэробов.
- •1 Этап.
- •2 Этап.
- •1 2 3 5 4
- •1 2
- •6 3
- •5 4
- •Биохимическая идентификация микроорганизмов
- •Определение биохимических свойств микроорганизмов
- •Идентификация микроорганизмов без выделения чистой культуры
- •Принципы молекулярно-генетического анализа
- •Классификация молекулярно-генетических методов
- •Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов
- •Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.
- •III. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.
- •Характеристика стадий пцр
- •Анализ результатов пцр
- •IV. Методы анализа амплифицированных фрагментов.
- •V. Методы, основанные на определении последовательности нуклеотидов в днк, рнк и аминокислот в белках.
- •VI. Методы, основанные на модификации генетической информации.
- •Характеристика штаммов e. Сoli, участсвующих в процессе конъюгации
- •Определение факторов патогенности бактерий
- •5. Капсула.
- •7. Изучение неизвестных токсинов и других факторов патогенности микроорганизмов, механизмы действия которых недостаточно изучены.
- •Методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикам
- •Классификация методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
- •Основные понятия
- •Дискодиффузионный метод
- •Пропорционален антибиотикочувствитель-ности микроорганизма
- •Метод разведений в агаре
- •Метод разведений в жидких средах
- •Е-тест (эпсилометрический метод)
- •Ускоренный метод
- •Автоматизированнный метод с использованием автоматических микробиологических анализаторов
- •Генетические методы
- •Некоторые резистентные формы микроорганизмов, получающие эпидемическое распространение.
- •1 Этап эсми. Взятие и обработка материала.
- •2 Этап эсми. Выбор и заражение лабораторного животного.
- •3 Этап эсми.
- •Общие принципы серологического метода исследования
- •I. Достоинства слми:
- •II. Недостатки слми:
- •Общие принципы аллергологического метода исследования
- •I этап алми. Сбор аллергологического анамнеза с целью:
- •II. Недостатки алми:
- •Литература
- •Электронные источники научной информации
- •Оглавление
Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов
-
Типы рестриктаз
Рестриктаза
Сайт распознавания
Макрорестриктазы, распознающие последовательности из 6 и более нуклеотидов
SmaI
5'...C C C^G G G...3'
3'...G G G^C C C...5'
SalI
5'...G^T C G A C...3'
3'...C A G C T^G...5'
XbaI
5'...T^C T A G A...3'
3'...A G A T C^T...5'
Стандартные рестриктазы
HaeIII(BsuRI)
5'...G G^C C...3'
3'...C C^G G...5'
Примечание. ^ - место рестрикции.
Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.
Молекулярная гибридизация - молекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.
Методы молекулярной гибридизации позволяют выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.
Варианты проведения молекулярной гибридизации.
В растворе.
В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.
На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.
На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.
Этапы реакции гибридизации на мембранах:
А. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.
Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК (не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.
В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:
– дот-блоты или слот-блоты. Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).
– саузерн-блоты. Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.
Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 800С или УФ светом.
Г. Гибридизация проводится в несколько этапов:
– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;
– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;
– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 650С.
Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета (рис. 30).
Рис. 30. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченным зондом