Выделение фона.

Можно отличить фон от объекта по яркости, но в любом случае по краям в микроскопе изображение будет темным. На глаз не воспринимаются все градации яркости.

I(изобр.)+I(неравн. освещения)+I(дефектов камеры с точками)+(I(шумов))=I(изображения)

Математически отсюда можно выделить изображение с шумами.

Варианты получения изображения:

-нескорректированное (все 4 компоненты)

-убрать препарат, снять пустое поле - сохранение дефектов и освещения - наибольшая яркость камеры

Коррекция изображения (более сбалансированная яркость): скорр.=сред. яркость сырого кадра*(сыр.-тем.)/(пустое-темн.) Недостатки исправляются при разнице яркости 15% между точками.

Сегментация и подсчет

-уменьшение трудоемкости процесса при работе в программе

-получившиеся контуры можно использовать как маски изображения

-объекты при съемке (неск. %) портят статистику, если не входят в кадр. Они не учитываются при подсчете в программе

-объекты "с отверстиями" - можно подсчитать только отверстия или наоборот без него

Оценка оптической плотности, яркости

в программе - добавление еще одного цвета в изображение или пересчет цветов в другие. При измерении границы областей выделяется область на изображении и строится график среднего значения каждого столбца.

Фильтры-свертка (конволюция) - для подсчета не отдельных клеток, а ацинусов и т.д. - размытие изображения и перенос на начальную с подсчетом яркости (чтобы были видны контуры объектов)

Конволюция связывает исходное и получившееся изображение (произведение матриц четкость*размытие или оригинал*произведение). Небольшая разница в значениях превращается в большую

Медианный фильтр - позволяет отсортировывать значения по бокам матрицы. Применяется для уменьшения шума. Получается размытое изображение, но в нем нет шума.

Нерезкая маска - тоже фильтр, для четкости краев без повышения шума и создания изъянов. Самый крутой фильтр.

Частотные фильтры - при совм. передаче нескольких узкополосных сигналов в общей частотной полосе необходимо их суммировать при допустимых искажениях. Эти искажения убирают частотные фильтры

Основные ошибки

-использовать форматы с сжатием без потерь, 16 или 32 бит, для обработки изображений

-фильтры - не панацея. Не следует использовать их для исправления ошибок съемки или ошибок приготовления препарата

-всегда указывайте, какая обработка была применена и на сколько

-не обрабатывать изображения слишком сильно и оставлять необработанный вариант для сравнения

-перед публикацией цветных изображений проверить их в СМУК

-убедиться что разрешение достаточно

-убедиться, что на изображении нет важных деталей в 15% от черного и белого цвета - эти детали потеряются при печати

Обратная свертка (деконволюция)

Свет имеет разные максимумы на разных частях изображения.

Главное преимущество конфокальной микроскопии – позволяет сфокусироваться на точке, когда другие тоже флуоресцируют.

Есть функция, описывающая распределение света на картинке – особый математический аппарат. F*g=h

Свет, прошедший через оптическую систему проэцируется на экран не в виде точки. Изображения в фокусе и не в фокусе различаются. Если сделать серию изображений по глубине препарата – картина складывается из нескольких слоев.

Любое изображение из флуоресцентной микроскопии рассматривается как стопка изображений, и есть функция, описывающая их. Для нее можно найти обратную функцию. Можно найти изображение, находящееся в фокусе – метод деконволюции:

*можно перераспределить свет из уровней выше/ниже точки в ней

*шум можно убирать

Минусы:

*нужен тонкий препарат

*грязь на препарате восстанавливается лучше, чем препарат

ПРИНЦИП: есть возможность функцией описать чем полученное изображение отличается от исходного, вернуть исходное. Разрешение не увеличить!

3D реконструкция

Проекция – в объеме – при ее наложении видим, как глубоко лежит та или иная точка. Z-проекция конфокальной микроскопии – наложение всех слоев.

Реконструкция – поверхность

Возможность делать сечения и проводить измерения

Вопросы.

Из чего складываются шумы при использовании КМОП и ПЗС матриц? Тепловой, шум системы усиления, ближний (фотонный) – много фотонов рассеиваются, борьба - увеличение выдержки и интенсивности

1. Биннинг – считывание нескольких точек как одной. Увеличивается чувствительность, скорость считывания

2. Как получить цветное изображение препарата в проходящем свете при использовании монохромной камеры – поставить фильтры 3х основных цветов, а потом сложить

3. Как устроена цветная матрица с фильтром Байера, в чем ее недостатки – цветная матрица, в которой каждая ячейка пропускает определенный свет. Недостаток – флуоресценция неяркая, для красного спектра в 4 раза меньше чувствительность

4. Какие параметры матрицы необходимы при использовании объектива 40Х 1,3NA с полем зрения 250х250 мкм, используя эпифлуоресцентный режим для изучения распределения слабо флуоресцирующего в зеленом свете флуорохрома, если в фокальной плоскости объектива изображение проецируется размерами 36х36 мм.

Есть увеличение, есть расстояние между точками (разрешение). Исходно – 250 мкм – четверть микрона - через 40х увеличение – получаем 25 микрон. По критерию Нахерста – в 2 раза больше точек – 12,5 микрон

Из исходных данных – получаем разрешение по формуле из длины волны и апертуры. Из разрешения (поле 250*250) можно высчитать число точек, а потом умножаем на 2 (чтобы была вероятность того, что можно различить точки )

X.

Хочется:

-регистрировать 1 фотон (кв. эффективность)

-регистрировать вживую

-получить бесконечное разрешение и глубину

-микроскопировать толстые препараты

-микроскопировать несколько препаратов

Направления:

1. Сканирование in vivo – уже есть, через оптоволокно

2. Увеличение временного разрешения (скорости сканирования)

Скорость конфокала ограничивается скоростью луча. Зеркало в любом случае обладает массой – чтобы ускорять его нужна энергия. В итоге целостность его будет нарушена. Но если сделать зеркало гибким – оно будет иметь собственную резонансную частоту.

Если про обычный широкопольный микроскоп – ограничивающий элемент – шумы и т.д. Сейчас есть камеры с внутренним усилением (квантовый пик до 90%)

3. Увеличение глубины сканирования

4. Увеличение аксиального разрешения

5. Увеличение латерального разрешения

6. Увеличение соотношения сигнал/шум – чтобы детектор не облад. шумом

7. Возможность спец. Методов – в конфокальной FRED, восстановление фотовыцветания после выжигания

8. Возможность стат. Анализа очень малых отклонений

9. Удобство инструмента

Микроскопия полного внутреннего отражения

При определенном угле падения (угол между падающим и отраженным лучом=90*) при переходе луча из ОБП в ОМП образуется экспоненциально затухающая волна, которая направляется на микроскопируемый объект. (зона ~200 нм)

Двухфотонная Лазерная Сканирующая Микроскопия

Фотоны взаимодействуют в плоскости фокуса (наиб. плотность) – свет регистрируется только в небольшой части изображения. Не нужна пинхол диафрагма – нет лишней флуоресценции. Есть возможность гораздо глубже визуализировать образец.

Противотуманные фары!

Используется менее вредный, чем УФ, ИК свет. Для возбуждения флуорохрома нужна длина волны ок. 800 нм.

Минусы – оооочень дорогой лазер, и если есть что-то меланиновое – оно сгорит из-за поглощения ИК света.

Функция распределения точки – отрезание всех хвостов вне точки, нет выгоды в разрешении

4-pi микроскопия

Хорошее разрешение мешает получить числовая апертура. Если заставить интерферировать свет от 2х зеркал – увеличивается разрешение по глубине. Используются другие физические закономерности для выделения нужной точки

STED – микроскопия

Позволяет тоже получить сверхразрешение – ограничение области, в которой возбуждается флуорохром. Лазер можно сделать на основе флуоресцентной краски. 1 фотона при возбуждении будет достаточно для потока. Флуоресцентный предел остается. Позволяет снимать двигающиеся объекты.

STORM, PALM, GSDIM

Как заставить флуорохром не все время светиться? Подход – перевести из флуоресцирующего в нефлуоресцирующее состояние либо очень ярким светом, либо с определенной длиной волны. Много раз это повторяя, можно локализовать отдельные молекулы флуорохрома. Центр функции распределения – то место, где находится флуорохром. Так можно отслеживать путь молекулы. Минусы – нельзя работать с динамическим процессом (неточно)

Структурированное освещение

Есть 2 изображения, издалека деталей не видно. Если их наложить друг на друга – получается муар. Если в качестве второго объекта- сетка с линиями в направлении объектных – получается разрешение выше дифракционного предела при восстановлении структуры объекта.

Микроскоп – фильтр высоких частот. При повторении сетки несколько раз получается очень хорошее разрешение. (она повторяется несколько раз в серии, поворачиваясь по кругу)

Флуоресцентная (кросс) корреляционная спектроскопия

В конфокальном микроскопе можно остановить луч на одной точке. Если клетка живая – белки диффундируют и проходят через этот объем, флуоресцируя. Флуоресценция зависит от объема, скорости диффузии и т.д. Если количество белка, связанного с флуорохромом, уменьшается – можно пометить оба белка и смотреть как изменяется концентрация на графике.

Оценка колокализации в клетке каких-л. веществ:

1. Конфокальность – несколько белков, в каком компартменте

2. FRET – взааимод. Ли объекты, два флуорохрома, спец метод

3. FLIM-FRET количественная оценка этого и наличие/отсутствие взаимодействия по выцветанию

4. FRAP – выжигание части флуорохрома и скорость восстановления

5. FCS – концентрация и диффузия молекул, улучшенный метод. Большие молекулы не будут двигаться по Броуну+имеет значение вязкость и концентрация среды. Если молекула большая – она долго пересекает область с флуорохромом и интенсивность по времени изменяется медленно; с маленькими молекулами – наоборот. Корреляция наблюдается и когда 2 маленькие молекулы диффундируют совместно через участок флуорохрома. Возможности – оценка концентрации, скорости диффузии, оценка взаимодействия белков, фермента и субстрата, способа транспорта в клетке (активный/пассивный) – имеем 3 кривых распределения, из которых можно делать выводы. Метится только 1 молекула!

6. FCCS - % молекул; метятся уже 2 молекулы, а не одна, как в предыдущем случае.

7. CLEM- correlated light electron microscopy. Ультраструктура вокруг объекта исследования.

HCS – High Content Screening. Цитомика

Чтобы набрать большую статистику, нужны автоматизированные методы (измерения «на глазок» неточны).

Нужно:

-взять 96 луночный планшет

-получить изображение каждой лунки

-при помощи морфометрии сегментировать полученные изображения (соотношение ядер и цитоплазмы, определить (DAPI) фазу клеточного цикла окрашенных клеток)

Цитомика – совокупность всех «-омик» по клетке – протеомики, геномики и т.д.

Проточная цитофлуориметрия

Среда с суспензированными клетками – бывшая «приклеенная». В потоке физ.раствора или воды эти клетки можно считать, фиксируя прохождение каждой.

Нужно заставить их идти одна за другой (учет размера клетки), уменьшить запросы (нельзя каждую сфотать и как следует рассмотреть).

Решение проблем:

1. Клетка пойдет одна за другой, если капилляр с суспензированными клетками опустить в раствор с большим давлением, чем в капилляре – гидрофокусирование. Каждая выходящая клетка как бы отодвигается окружающей жидкостью под давлением.

2. Регистрация – лазером с одной стороны и фотоэл. умножителем с другой.

При переднем рассеянии (лазер закрыт экраном) действует рассеяние Ми – регистрация размера клетки.

При боковом рассеянии, когда нет зависимости распространения рассеяния, действует рассеяние Релея – объекты~2 нм – это мембрана и т.д. Можно рассмотреть ультраструктуру клетки.

ФЭУ детекции флуоресценции регистрирует метки на клетке.

Гейтирование, тандемные флуорохромы

Сбоку – размер, сверху – сложность внутренней структуры. Пятна на экране – либо группы клеток по структуре и размерам, либо различно меченые клетки по CD поверхности. (напр. T, NK клетки )

Ограничение данных для дальнейшей обработки – гейтинг.

Плюсы:скорость, статистическая сила, регистрация большого числа (до 16) меток одновременно.

Сложность:для возбуждения флуоресценции используют лазер, т.к. нужна большая мощность. Нужно при 1 возбуждающем свете получить как можно больше меток...Решение – FRET-пары с перекрывающимися спектрами возбуждения и испускания, красители с большим сдвигом Стокса.

Взаимопроникновение каналов – от кубика одного флуорохрома появляется излучение другого и т.д. При большом сигнале невозможно будет разделить соседние флуорохромы при достаточном перекрытии их спектров – будет непонятно, какой это флуорохром. Разделить их можно только зная соотношения флуорохромов=спектральный анмиксинг.

FACS:Fluorescence activated cell sorting

Когда интересуют группы клеток с определенной структурой, размерами и метками – можно на выходе из капилляра создать очень маленькие капельки и поместить там металлическую пластинку с напряжением. Капля после отрыва заряжается на напряжении и после этого попадает в пространство между двумя эжлектродами. При наличии + или – заряда идет сортировка капель.

Рассеяние света

Кроме флуоресцентных меток важны размеры клеток и их внутренняя ультраструктура.

Релеево эластичное рассеяние:

1. Рассеяние света зависит от частиц, на которые попадает свет.

2. Чем больше длина волны – тем меньше рассеяние.

3. Рассеяние во все стороны примерно одинаково

Если объект примерно равен по размерам длине волны света – рассеяние Ми:

1. Зависимость много меньше зависит от длины волны

2. Рассеяние идет на меньший угол, в основном вперед

3. Чем больше объект, тем меньше угол рассеяния

Вопросы:

1. В чём преимущества двухфотонной микроскопии? как конфокальная, но не нужен пинхол

2. Какую длину волны Вам нужно выбрать на двухфотонном микроскопе для активации

флуорохрома с максимумом поглощения 380нм? ИК свет, не образуются свободные радикалы, лучше выживают клетки, глубина будет больше. Рассеяние в ткани больше у коротких длин волн – красный свет может глубже проникнуть в ткань

3. В чём суть микроскопии полного внутреннего отражения? Какие возможности имеет

этот метод исследования? – можно смотреть на обычном микроскопе, самый верхний слой препарата

4. Для чего нужен резонансный сканер в конфокальном микроскопе? Скорость сканирования ограничена – в каждый момент времени видим только одну точку, кот. передвигается движ. зеркалами. Зеркало имеет массу, ограничивает движение точки. Если зеркало ввести в резонанс – скорость будет выше

5. Какие преимущества даёт использование ≪белого≫ лазера? – содержит несколько различиных спектральных линий различных цветов, отчего луч получается белым; излучение не только одной длины волны, а когерентного мультиволнового излучения со сверхшироким спектром. Создает помехи в ИК диапазоне и может эффективно имитировать эл/маг сигнатуру двигателей, создавать помехи УФ каналам

Не все флуорохромы можно возбуждать 1 длиной волны – белый лазер (ИК лазер со спец. растягивающим оптоволокном) дает возможность регистрировать флуорохромы всех длин волн

6. В чём суть микроскопии полного внутреннего отражения ?

7. В чём преимущества 4-pi микроскопии ?

8. В чём преимущества STED микроскопии ? – относится к методам сверхразрешения – получение информации с меньшей дифракцией. Увеличение и латерального, и аксиального разрешения

9. В чём суть микроскопии структурированного освещения (SI) ?

10. Какие параметры позволяет оценить флуор. корр. спектроскопия? Скорость диффузии белка, количество меченых белков вместе и раздельно

11. В чем преимущество HCS по сравнению с конфокал.? Скорость+стат. оценка+поиск редких событий не по одной клетке

12. В чем преимущества проточной цитофлуорометрии? Статистика

XI.

Основы электронной микроскопии

Взаимодействие электрона с в-вом

Видимый свет – не повреждает, видим, легко манипулировать – но длина волны больше 400 нм

Рентген – хорошо проникает, длина волны до 0,1 нм – но повреждение образца и сложно манипулировать

Электроны – длина волны меньше 0,001 нм, можно манипулировать – но повреждение образца, плохое проникновение

Нейтроны – длина меньше 0,0001 нм, слабое повреждение – но сложно получать и манипулировать

Типы взаимодействия –

- упругое рассеяние (обратное или вперед) – больше с увеличением номера атома. НЕТ ОБМЕНА ЭНЕРГИЕЙ

-неупругое рассеяние (обмен энергией с электроном верхней орбитали с потерей части энергии на тепло) – генерация вторичных электронов и рассеяние на небольшие углу. ЕСТЬ ОБМЕН ЭНЕРГИЕЙ И ОБРАЗОВАНИЕ ВТОРИЧНЫХ ЭЛЕКТРОНОВ

-без рассеяния

После попадания на образец – варианты:

-нет рассеяния

-первичное обратное

-вторичное обратное

-выбивание из образца + иона

-катодолюминесценция

-рентгеновское излучение

-эластично рассеянные – не было обмена энергией, не изменилась скорость

-неэластично рассеянные

На электрон можно действовать электростатическими и магнитными линзами. Если поле не гомогенное (с металлическим экраном) – электрон начнет двигаться по спирали, но суммарно преломится. Если маг.линза будет в центре – электрон не преломится (как ГОО в оптике). Но выходить из спирали электрон будет не только преломленным, но и с поворотом – еще один вид дисторсии.

В зависимости от длины волны, как в хроматической аберрации, меняется положение фокуса. Неэластично рассеянные электроны мешают.

Негомогенное маг.поле дает сферическую аберрацию – электроны с краю будут испытывать большее воздействие

Линзы для эл. микроскопа – лучше всего участок - ближний к ГОО. Пучок может не зайти в линзу, дать огромную аберрацию.

Нужны небольшие углы электронов к ГОО (пара электродов с напряжением электростатически выравнивает пучок = дефлекторная пара) и ограничение лучей под слишком большим углом (решение - апертура!)

Ровная и симметричная картинка напряженности (удаление астигматизма) достигается стигматорами – металлическими пластинами, корректирующими преломление по одной из плоскостей.

Линза в электронном микроскопе – гораздо более сложная оптическая система, чем в электронном. Они обладают достаточно низким качеством. Чем с большей энергией будут проходить электроны — тем больше они будут отклоняться. Лучи, проходящие ближе к краю линзы, будут преломляться сильнее.

Дисторсии — это геометрические искажения (точка оказывается на экране ближе или дальше, чем была), а аберрации - «размытие» точки.

В электронной микроскопии линзы оперируют с очень небольшим углом пучка (до 1 градуса). Для исправления этого есть дефлекторная пара, позволяющая отцентровать пучок.

Аберрация АСТИГМАТИЗМ — по осям различие силы линзы — устраняется парой стигматоров после линзы, на которые подается напряжение.

Разрешение эл. Микроскопа — (сумма искажений в квадрате)^1/2

Источники электронов — преодоление работы выхода:

• радиоактивные источники

• нагревание металла — термоэмиссионные источники — Но — хроматическая аберрация и очень большое пятно, из которого выходят электроны. Металлы — вольфрам и непроизносимая лажа-монокриссталл (последний позволяет получить более когерентное излучение)

• источники с пылевым излучением — проволока очень остро затачивается, и напряженность поля на этом острие будет возрастать — этой разницы потенциалов хватит, чтобы выдернуть электроны из металла. Плюсы — очень небольшая разница энергий электронов и очень маленький диаметр источника. Минусы — очень дорогие, требуют высокого вакуума

Как их можно разогнать:

• электрическим полем

Детекторы:

• катодолюминесценция. При попадании на такой экран (ZnS «фосфор») электроны вызывают активное свечение – просвечивающий электронный микроскоп

• кремниевый - полупроводник, при попадании электронов начинает работать

Оптическая схема микроскопа:

ПЭМ — вместо нити накаливания термоэмисс. Катод, конденсор сверху, пучок электронов, тонкий объект, объективная линза

СЭМ — получение изображения не напрямую, а зондирование каждой точки объекта тонко сфокусированным пучком. Используются вторичные обратнорассеянные электроны, рентген. В каждый момент времени пучок электроно попадает только на 1 точку объекта.- как в сканирующем конфокальном микроскопе. Регистрация электронов — различия по энергии:вторичные электроны (дают атомный номер) с меньшей энергией, а первичные с большей. Если собирать электроны с достаточной энергией и заставить их идти обратно к детектору — это будут высокоэнергичные электроны (обратное рассеяние)

Просвечивающая электронная микроскопия

Регистрация внутренностей — эластично рассеянные электроны на большой угол и неэластично рассеянные — некогерентные — нерассеянные и эластично рассеянные на малый угол — когерентные.

Проблемы:

• Чем толще образец — тем больше шанс на многократное рассеяние одного электрона. Нужны тонкие срезы.

• Шанс рассеяния, а значит контраст — не очень большой. Для лучшего рассеяния нужны крупные элементы, а живое состоит из легких. Можно уменьшить апертуру, но от этого страдает разрешение (возникает дифракция). Можно окрасить — солями тяжелых металлов (Os, Pb, U).

• нужна лучшая фиксация образца (формалин, а лучше глутаровый альдегид — сшивает, а не осаждает белки), заключение в вещество для очень тонких срезов — эпоксидные смолы, очень тонкие срезы (до 70 нм)

Сканирующая ПЭМ

Некий гибрид СЭМ и ПЭМ. Сканирование в просвечивающем режиме объекта точка за точкой. Можно очень контрастно увидеть изображение — обработка ткани коллоидным золотом.

СЭМ (растровый ЭМ)

Образец толстый

Только взаимодействия, идущие со стороны пучка — первично обратно рассеянные электроны с небольшой энергией

Сбор информации — линза, фокусирующая на образец пучок электронов для поточечного сканирования, детекторы (получение информации о первично и вторично рассеянных электронах). Информация о химическом составе — первично рассеянные, о поверхности — вторично рассеянные!

Само по себе взаимодействие имеет зону, глубину — и она отличается для разных — первичных и вторичных — электронов: чем больше выход этой зоны на поверхность — тем больше 2ых электронов излучается — топографическая информация об образце.

Информацию о 1ых и 2ых электронах можно получать одновременно. Но чаще используют детекторы на топографию и детекторы на состав.

Пробоподготовка к СЭМ, напыление

-проводящие твердые образцы

-непроводящие твердые образцы

-мягкие оводненные образцы

Почти все живые объекты не проводят электричество и плохо рассеивают тепло. Поэтому на образцы обычно напыляется металл (золото, хром). Это все для непроводящих твердых образцов

Для подготовки мягких оводненных образцов используют сушку в спирте и других веществах, сушку в критической точке-когда нельзя сказать, жидкость это или газ, сушку замораживанием — но здесь есть шанс на сублимацию и образуются кристаллы льда, уменьшающие разрешение. (выход - криопротектанты)

(т. к. поверхностное натяжение воды приводит к изменению морфологии объекта при простой сушке).

Замораживание-скалывание-травление

После замораживания и скалывания дают некоторое время на испарение воды при некоторой температуры (жиры и т. д. Остаются в кристаллической форме)

Повреждения кристаллами льда можно обойти:

• аморфный лед — при быстрой заморозке кристаллы не образуются. Хорошо для ПЭМ.

• Заморозка при высоком давлении — не подходит для рутинной работы

КОНСУЛЬТАЦИЯ

Что такое эпифлуоресценция, зачем она нужна?

Можно освещать меченый флуорохромом объект с любых сторон. Если освещать снизу — будет виден и возбуждающий свет, и флуоресценция — их придется разделять, но это не очень удобно, поскольку их интенсивность не сравнима. При освещении перпендикулярно сверху регистрируется только отраженный свет и флуоресценция. Тогда большая часть возбуждающего света пройдет через препарат и отношение отраженного света и флуоресценции будет примерно равным — в таком случае фильтры способны отделить одно от другого.

Почему испускаемый флуорохромом свет не монохромен?

Длина волны испускаемого света больше, чем длина поглощаемого, поскольку при поглощении часть энергии рассеивается в виде тепла, а излучение света большей длины волны

требует меньше энергии.

Не монохромен возбуждающий свет, фотоны флуоресценции могут иметь разные длины волн (при поглощении часть энергии возбуждающего света идет на излучение света определенной

длины волны при возвращении из возбужденного состояния в стабильное – т.е. флуоресценцию)

Что такое квантовая точка?

Это изолированные нанообъекты, свойства которых существенно отличаются от свойств объемного материала такого же состава. Сразу следует отметить, что квантовые точки являются скорее математической моделью, нежели реальными объектами. И связано это с невозможностью формирования полностьюобособленных структур – малые частицы всегда взаимодействуют с окружающей средой, находясь в жидкой среде или твердой матрице.

В стационарном состоянии КТ, обладающем наименьшей энергией, нижние энергетические уровни полностью заняты электронами.

Но под действием внешнего воздействия электрон вынужден переходить на более высокий, не занятый другими электронами энергетический уровень, приводя к образованию возбужденного состояния квантовой точки.

Посредством зарядовых взаимодействий электрон остается связан с «дыркой» и в любой момент может перейти обратно, также как пересевший зритель всегда может передумать и вернуться на обозначенное в его билете место. Пару “электрон-дырка” называют «экситоном» от английского слова “excited”, что означает “возбужденный”. Миграция между энергетическими уровнями КТ, аналогично подъему или спуску одного из зрителей, сопровождается изменением энергии электрона, что соответствует поглощению или излучению кванта света (фотона) при переходе электрона соответственно на более высокий или низкий уровень. Описанное выше поведение электронов в квантовой точке приводит к нехарактерному для макрообъектов дискретному энергетическому спектру, за который КТ часто называют искусственными атомами, в которых уровни электрона дискретны.

Сила (энергия) связи дырки и электрона определяет радиус экситона, который является характеристической величиной для каждого вещества. Если размер частицы меньше радиуса экситона, то экситон оказывается ограничен в пространстве ее размерами, а соответствующая энергия связи значительно изменяется по сравнению с объемным веществом (см. «квантоворазмерный эффект»). Не трудно догадаться, что если энергия экситона изменяется, то изменяется и энергия фотона, излучаемого системой при переходе возбужденного электрона на свое исходное место. Таким образом, получая монодисперсные коллоидные растворы наночастиц различных размеров, можно управлять энергиями переходов в широком диапазоне оптического спектра.

Первыми квантовыми точками были наночастицы металлов, которые синтезировали еще в древнем Египте для окрашивания различных стекол (кстати, рубиновые звезды Кремля получены по близкой технологии), хотя более традиционными и широко известными КТ являются выращенные на подложках полупроводниковые частицы GaN и коллоидные растворы наноокристаллов CdSe. В настоящий момент известно множество способов получения квантовых точек, например, их можно «вырезать» из тонких слоев полупроводниковых «гетероструктур» с помощью «нанолитографии», а можно спонтанно сформировать в виде наноразмерных включений структур полупроводникового материала одного типа в матрице другого. Методом «молекулярно-пучковой эпитаксии» при существенном отличии параметров элементарной ячейки подложки и напыляемого слоя можно добиться роста на подложке пирамидальных квантовых точек, за исследование свойств которых академику Ж.И.Алферову была присуждена Нобелевская премия. Контролируя условия процессов синтеза, теоретически можно получать квантовые точки определенных размеров с заданными свойствами.

Квантовые точки до сих пор являются «молодым» объектом исследования, но уже вполне очевидны широкие перспективы их использования для дизайна лазеров и дисплеев нового поколения. Оптические свойства КТ используются в самых неожиданных областях науки, в которых требуется перестраиваемые люминесцентные свойства материала, например, в медицинских исследованиях с их помощью оказывается возможным “подсветить” больные ткани. Люди, мечтающие о «квантовых компьютерах», видят в квантовых точках перспективных кандидатов для построения кубитов.

Что такое трейсерные красители? – позволяющие отслеживать перемещение меченого материала, оставляющие за собой след (to trace – отслеживать)

В чем преимущество метода непрямой иммунофлуоресценции над прямой?

Более чувствителен; для тестирования взаимодействия любого антигена с соответствующими антителами, образующимися в организме человека, необходим лишь один вид меченого реагента

Чем ратиометрический флуорохром отличается от обычного?

Свободное и связанное состояние имеют разные спектры поглощения и/или испускания, соотношение сигналов указывает на равновесное состояние связанного и свободного флуорохрома, возможно вычислить концентрацию интересующего иона

При конфокальной микроскопии значительно возрастает латеральное или аксиальное разрешение?

Аксиальное, по оси Z

Общее разрешение возрастает только до 1,4 раза. Обычный микроскоп – латеральное в 2-3 раза больше аксиального.

!!!!!!!!!!!!!!

НЕОБХОДИМЫЕ ФОРМУЛЫ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ КОНТРОЛЬНОЙ

— разрешение d=1,22L/2NA — если апертура объектива больше чем у конденсора — d=1,22L/(NAobj+NAcond)

- формула контраста

• зависимость угла и числовой апертуры объектива — NA=nsina

Расчет точек в поле зрения камеры:

Поле 210*210 микрон

NA=1,45

флуоресценция, длина волны=500 нм

посчитать разрешение d — прим. 210 нм — 0, 21 мкм

разделить 210 на 0,21 = 1000*1000

умножить на 2 — ответ 2000*2000 точек по осям

Аберрации и дисторсии

Дисторсия — геом. Неточность передачи изображения (спиралевидная (ПЭМ и СЭМ), подушка, бочка, кривизна поля — когда при проецировании изображения на плоский экран с вогнутого получается размытие некоторых точек, они оказываются без фокуса)

Аберрация — хроматическая (ее нет при монохромном свете), сферическая (все лучи не сходятся в одной точке — линза не везде преломляет одинаково — это зависит от угла прохождения луча, может быть + и -, чем толще покровное стекло — тем она больше. При совпадении прямого и обратного изображений она отсутствует) Кома — при удалении объекта от ГОО действует сферическая аберрация — для крайних лучей фокус окажется выше и в плоскости экрана они уже будут расфокусированы.

Различие комы и кривизны поля — кома:изменением фокуса нельзя исправить ситуацию, а при кривизне поля — можно сфокусировать центр или края препарата.