Отличительные особенности:

Очень стабилен при изменении температуры и рН

Стабилен по отношению к денатурации

В случае денатурации ренатурация происходит самопроизвольно

Кодируется единственным геном

Может быть трансфицирован в геном хозяина и реплицироваться вместе с ним

Может быть зафиксирован в формалине без потери флуоресценции

• «улучшенные» версии этого белка (EGFP) с большей квантовой эффективностью, однако более чувствительные к рН

• дестабилизированные версии GFP, например dEGFP (2 часа полу-жизни)

• мутантные версии GFP с разными спектрами (BFP,CFP, YFP)

• Ds-Red.

Фотоконверсия – изменение спектральных характеристик флуорохромного белка.

Флуоресцентный белок Kaede green может изменить спектр под действием УФ.

DAB может быть окислен с использованием флуорохромов с низкой квантовой эффективностью (напр. эозин), EM контрастирование OsO4.

Вопросы

1. В чём отличие между ратиометрическими и не ратиометрическими флуорохромами ?

Физиологические флуорохромы — качество

* Свободное и связанное состояние имеют разную КЭ

* Выявляются только локальные изменения яркости флуорохрома (возможно за счёт разной концентрации)

Ратиометрические флуорохромы — качество и количество

* Свободное и связанное состояние имеют разные спектры поглощения и/или испускания

* Соотношение сигналов указывает на равновесное состояние связанного и свободного флуорохрома

* Возможно вычислить концентрацию интересующего иона

2. Ратиометрические флуорохромы позволяют определить значение изучаемого

параметра за счёт:

1. Изменения сдвига Стокса

2. Изменения максимума поглощения да

3. Наличия изометрической точки

4. Изменения квантовой эффективности для единственной длины волны

поглощения при наличии единственного пика в спектре испускания - да

3. Какими свойствами обладает зелёный флуоресцентный белок ?

1. Стабилен в широких пределах pH да

2. Сохраняет флуоресцентные свойства после фиксации материала в формалине да

3. Кодируется единственным геном да

4. Чувствителен к изменению концентрации свободного Са++ нет

4. Чем отличаются EGFP и dsEGFP от GFP, для чего они могут быть использованы ? это дестабилизированные или красители с улучшенной квантовой эффективностью, используются для недолговременной окраски или для более яркой

5. Какой из мутантных флуоресцентных белков BFP,CFP, YFP обладает наименьшей

фотостабильностью ? BFP

6. Что такое фотоконверсия ? Фотоконверсия – изменение спектральных характеристик флуорохромного белка.

VIII.

Конфокальная микроскопия:рассеянный свет из глубины образца обрезается апертурами перед доп. сточником света и перед фотоприемником, что обеспечивает высокий контраст изображения

Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия.

Такие апертуры называются пинхол-диафрагмами. Диаметр пинхола очень важен для более тщательного отрезания рассеянного света. Максимально возможный выигрыш в латеральном разрешении = 1,4. Латеральное разрешение – это минимальное расстояние между двумя точками, расположенными перпендикулярно к ходу лучей.

Требования к системе:

-тонкий пинхол

-1,515 – масло и покровное стекло, 1,43 – среда для заключения (глицерин:вода 80:20).

Динамический контраст – диапазон изменения яркости от самого светлого к самому темному цвету – у конфокала пик яркости объекта гораздо четче, чем у обычного микроскопа.

Аксиальное разрешение у конфокала тоже выше, лучше там, где уже пинхол.

Рассеивание точки выше при большем диаметре пинхола

Теорема Котельникова – если аналоговый сигнал имеет ограниченный по ширине спектр, то он может быть восстановлен однозначно и без потерь по дискретным отсчетам, взятым с частотой строго большей удвоенной верхней частоты. (различить точки на изображении по яркости можно только, если есть третья, менее яркая, между ними).

Как посчитать разрешение детектора сканирования: найти разрешение по длине волны и NA и разделить поле зрения на разрешение. Возможно XYZ сканирование и т.д.

Сигнал/шум

Это соотношение - мера качества изображения, отношение сигнала к сумме всех шумов системы.

SNR=сигнал/шум. Может быть улучшен усреднением двух и более кадров.

SNR (общий) = SNR (кадра) * SQRT (кол-во кадров)

Детектор ФЭУ

ФотоЭлектронный Умножитель - сенсор, используемый для детектирования очень слабого света, практически “подсчёта фотонов”.

Главная характеристика – квантовая эффективность (отношение поглощенных фотонов, внесших в систему квант энергии и колебания, к общему числу поглощенных фотонов).

Считаем фотоны:ФЭУ

Высокое напряжение – регулирует усиление и шум ФЭУ

Усилитель – усиливает сигнал с ФЭУ

Усиление – мера увеличения сигнала на выходе по отношению к сигналу на входе системы

АЦП – аналого-цифровой преобразователь, преобразует непрерывное аналоговое значение тока в дискретную цифровую форму. Характеризуется разрядностью – конечным числом градация для аппроксимации аналогового сигнала. Наиболее часто встречающиеся – 8bit (256), 10bit (1024), 2bit

(4096).

ПО – контролирует процесс получения изображения

Искажения при оцифровке

АЦП – Привносит дополнительный электронный шум (небольшое количество), шум квантования (гармоники тактового сигнала, значительны в случае если тактовая частота сопоставима с четверьтью частоты исследуемого сигнала), линейные и нелинейные искажения.

Програмное обеспечение – контролирует процесс получения информации, может приводить к значительной потере информации из-за неверной настройки детектора и к определённой потере информации при обработке если вычисления ведутся в целых числах.

Искажения динамического диапазона могут быть линейными, нелинейными и комплексными.

Компромисс: пространственное разрешение-временное разрешение-интенсивность и сигнал/шум

Получение изображения

1. Найти и сфокусировать микроскоп на объекте исследования

2. Перевести микроскоп в режим работы с конфокальной насадкой

3. Используя программное обеспечение, выбрать лазер, установить его мощность (~5-10%)

4. Выбрать подходящую светоделительную пластинку

5. Установить границы регистрации спектра эмиссии флуорохрома

6. установить подходящую скорость сканирования и режим сканирования

7. установить разрешение сканирования

8. Включить ≪живое≫ сканирование

9. Найти плоскость препарата с наибольшим сигналом

10. При необходимости отрегулировать пинхол

11. При необходимости подстроить границы регистрации спектра эмиссии флуорохрома

11. Настроить динамический диапазон детектора (Смещение и усиление)

12. Подобрать разрешение сканирования и увеличение сканирования для того, чтобы не потерять разрешение

13. При необходимости использовать накопление или усреднение изображений

14. Задать границы сканирования

15. Произвести сканирование для получения пачки изображений

16. Сохранить полученные данные

Одновременное сканирование нескольких флуорохромов осуществляют акустооптический настраиваемый фильтр и использование нескольких детекторов на TCS SP5 (требует особого программного обеспечения)

Плюсы и минусы конфокальной микроскопии

■ Достоинства

 Меньше света вне фокуса, чётче изображение

 Плавное увеличение

 Оптические срезы

 Возможность 3М реконструкции

 Большее динамическое разрешение

 Возбуждение одной длиной волны

 Высокая чувствительность

 Возможность использовать множество меток

 Специальные методы (FRAP, FRET, …)

■ Недостатки

 Специализированное дорогостоящее оборудование

 Низкое временное разрешение (для простых моделей)

 Необходимость навыков работы

Конфокальная микроскопия позволяет визуализировать такие процессы, как транспорт белков и их функциональную локализацию.

■ FRAP – восстановление флуоресценции после фотовыцветания

 Позволяет увидеть насколько мобилен исследуемый белок

■ FLIP – потеря флуоресценции при фотовыцветании

 Позволяет увидеть, возможен ли транспорт белка из одного клеточного компартмента в другой

■ FRET – флуоресцентная резонансная передача энергии

 Позволяет определить насколько близко располагаются в клетке изучаемые белки

Возможности флуоресцентных методов

 Внутриклеточное распределение макромолекул в таких структурах, как мембраны, элементов цитоскелета, хроматина и т.д.

 Изучение внутриклеточной динамики макромолекул (FRAP)

 Изучение взаимодействия макромолекул (FRET)

 Определение внутриклеточной концентрации ионов (кальций, pH)

 Выделение отдельных клеточных органелл и белков цитоскелета

 Изучение реакции клетки или её органелл при воздействии исследуемых веществ на ограниченный участок клетки (Анкейджинг)

 Изучение выживаемости клеток при определённых воздействиях (DAPI + PI)

 Изучение клеточных функций (эндоцитоз, экзоцитоз, передача сигналов, трансмембранный потенциал)

 Изучение месторасположения определённых участков ДНК (FISH)

 Изучение экспрессии определённых генов и синтеза определённых белков (GFP)

Вопросы

1. За счёт чего изображение, полученное на конфокальном микроскопе, более

контрастно чем полученное на обычном флуоресцентном микроскопе?

1. За счёт уменьшения количества света от объектов, находящихся вне фокуса да

2. За счёт уменьшения вторичных максимумов диффракционной картины да

3. За счёт значительного роста латерального разрешения

4. За счёт использования лазера в качестве источника возбуждающего света

2. К чему приведёт уменьшение пинхола с 2AU до 0.5 AU ?

1. К незначительному увеличению латерального разрешения и значительному

увеличению аксиального разрешения да

2. К значительному увеличению латерального разрешения и незначительному

увеличению аксиального разрешения

3. К уменьшению света, попадающего на детектор да

4. К росту ≪ближнего≫ или фотонного шума в случае той же интенсивности

возбуждающего света

3. Возможно ли ≪в живую≫ увидеть изображение получаемое на сканирующем

конфокальном микроскопе ? да, в режиме живого сканирования

4. Для чего нам нужна настройка усиления и смещения ФЭУ? для увеличения сигнала и посылания его четко в одном направлении в детектор

5. Из чего складывается общий шум изображения, получаемого с конфокального

микроскопа, использующего фотоумножитель? из SNR кадра и SNR ФЭУ

6. Какими способами можно улучшить соотношение сигнал/шум? усреднение двух и более кадров

7. Сколько градаций сигнала можно получить используя 12 разрадный АЦП? 4096

8. Возможна ли одновременная регистрация нескольких флуорохромов при

использовании конфокального микроскопа? Что для этого необходимо? возможна, необходим AOTF или несколько детекторов на TCS SP5

9. При одновременном сканировании нескольких флуорохромов на фиксированном

препарате наблюдается взаимопроникновение каналов. Каким способом можно это

избежать? покрасить ими неперекрывающиеся области или взять флуорохромы абсолютно разных спектров испускания

10. Чему должно быть равно разрешение сканирования чтобы не потерять разрешение

оптической системы? отношению поля зрения к разрешению опт. системы

IX.

Шумы.

Всегда кроме рег. изображения есть еще шум самой системы.

1.В конфокальной микроскопии есть один из вар-тов шума - возможна только приближенная статистика распределения фотонов - это ближний фотонный шум. Борьба - увеличение кол-ва фотонов - флуорохромы, ув. времени экспозиции, яркости возбужд. света.

2.Тепловой шум - матрица чувствительная в ИК свете и сама может его регистрировать, также при наличии температуры электроны переходят из одной точки пр-ва в другую - тоже шум (ночное небо). Если матрицу охлаждать - получается меньший шум - матрицы в совр. микроскопии используют охлаждающие системы.

3.Сама матрица неидеальна, заряд распределен неравномерно.

4.Высокоэнергичное (рентген) излучение тоже регистрируется матрицей.

Искажения.

1. Блуминг - при накапливании в одной ячейке заряда с отсутствием его в соседних он будет растекаться на соседние. При считавании столбцов матрицы заряд перетекает из одной ячейки в столбце в другую. На современных матрицах есть предотвращающие блуминг системы, но на устройствах повышенной чувствительности их нет.

2. Фотодетекторы очень чувствительны к ИК свету

Параметры матриц

1.Квантовая эффективность - число электронов от одного фотона, не 100% регистрация каждого фотона. Зависит от длины волны. Позволяет подбирать флуорохромы.

2.Спектральная чувствительность

3. Количество точек - для больших увеличений и малого разрешения большое кол-во точек плохо. Чем больше точек - тем больше шума - поэтому научные камеры имеют систему охлаждения, они ч/би т.д., чтобы бороться с шумом. Шум для нескольких маленьких точек, расположенных рядом, достаточно велик.

4. Размер точки - чем меньше тем лучше

5. Колво кадров в секунду - сколько считываний можно сделать в секунду

6. Вместимость потенциального колодца (динамический диапазон) - число накопленного заряда в одной точке матрицы

7. Шум считывания

8. Температура работы - охлаждение на 10 град - меньше в 4 раза шума

9. Разрядность АЦП - от 12 до 16 бит

Параметры съемки

1. Экспозиция - кол-во параметров в точке*кол-во заряда, лучше увеличивать когда препарат неподвижен

2. Яркость препарата

3. Усиление (чувствительность) - умножение заряда в каждой точке на какую-то константу с учетом и изображения и шума - когда препарат подвижен

4. Регион интереса

5. Биннинг – это суммация заряда в соседних ячейках матрицы со снижением разрешения и повышением шума.

Программа ImageJ:

-калибровка - пересчет чему равна 1 точка изображения из единиц СИ. Получают калибровочной линейкой с помощью спец программного инструмента;

-ручные измерения - проводятся после калибровки для любого объекта. Проблема - появляется погрешность+трудоемкость;

-контраст, яркость, гамма - для преобразований применяют графики, где по оси Х откладывают исходную яркость, а по У - полученную. Если яркость не изменилась - будет прямая под 45 град. При изменении прямая сдвигается. При увеличении яркости теряются данные о светлой части, при затемнении - о темной. В большинстве научных программ - гистограммы - кол-во точек в светлой и темной частях.

Изменение контрастности аналогично. При изменении контраста опять же может теряться некоторая часть данных.

Для увеличения наглядности (увеличение контраста без потери данных в некоторых частях) можно исп. инструмент ГАММА. При гамма=1 ничего не меняется. При гамма<1 увеличение только в теной части. При гамма >1 - в светлой. Казалось бы, данные не теряются, но отбрасывается дробная часть (остаток) при нецелом делении: 10/3 *3=10 в дробных числах, но 9 в целых! Чем больше увеличение разрядности - тем больше ошибка.

Есть "данные с плавающей точкой", формат, позволяющий избежать потери данных. (*.tif) Но не все программы его воспринимают. Пример - Fidji, ImageJ.