Вопросы

1. Фазово-контрастная микроскопия отличается следующими особенностями

• Позволяет визуализировать амплитудные объекты

• Позволяет визуализировать фазовые объекты

• Визуализирует разницу только в толщине фазовых объектов

• Визуализирует разницу только в коэффициенте преломления фазовых объектов

• Визуализирует разницу в оптическом пути

• Требует установки поляризатора и анализатора

• Разрешающая способность зависит от ориентации объекта

• Имеет артефакт на границы фаз – гало

• Не позволяет точно измерить разницу оптического пути для протяжённых объектов из-за «затенения»

• Использует только D – лучи (образовавшиеся в ходе дифракции на объекте)

2. DIC микроскопия (Номарский)

• Позволяет визуализировать амплитудные объекты

• Позволяет визуализировать фазовые объекты

• Требует установки поляризатора и анализатора

• Разрешающая способность зависит от ориентации объекта

• Использует только D – лучи

• Визуализирует разницу в оптическом пути

• Визуализирует первую производную от разницы в оптическом пути

• Основана на взаимодействии ординарного и экстраординарного лучей, получаемых

• на призме из материала с двойным лучепреломлением

• Позволяет получить объёмное изображение препарата

• Позволяет получить псевдо-объёмное изображение препарата

3. MCM микроскопия (Хоффман)

• Позволяет визуализировать амплитудные объекты

• Позволяет визуализировать фазовые объекты

• Требует установки поляризатора и анализатора

• Разрешающая способность зависит от ориентации объекта

• Использует только D – лучи

• Основана на значительном ослаблении S – лучей

• Позволяет получить объёмное изображение препарата

• Позволяет получить псевдо-объёмное изображение препарата

4. Что отличает внутреннюю структуру вещества, обладающего свойствами

двойного лучепреломления?

анизотропичность

5. Что означает изменение интенсивности в методе дифференционного интерференционного контраста?

Изменение рельефа обьекта в силу разного свето-преломления на разных участках объекта

6. Что означает изменение интенсивности в методе фазового контраста?

Именение днинны волны

7. Какой из методов предпочтительнее использовать для трёхмерной реконструкции,

почему?

DIK MCM

8. Какую роль играет полоска с 15% пропусканием в методе контрастирования по Хоффману?

Видим , что объект на этом участке плоский

9. Какой из методов нельзя использовать для исследования культуры клеток в пластиковой культуральной чашке? DIK

10. Какой метод предпочтительнее при исследовании с одновременном использованием проходящего света и эпи-иллюминации (для флуоресцентной микроскопии)

MCM

11. Какой из методов имеет разное разрешение в зависимости от ориентации образца?

DIC

12. Какой из методов имеет наилучшее разрешение по плоскости препарата?

DIC

V.

Основы флуоресценции

Флуоресценция – это излучательный переход возбужденного состояния с самого нижнего сингклетного колебательного уровня S1 или S2 в основное состояние S0. Фосфоресценция - замедленная флуоресценция в состояние Т1 (триплетное возбужденное). При этих процессах наблюдается внутренняя конверсия и колебательная релаксация.

Сдвиг Стокса – разница в максимумах спектра эмиссии и спектра возбуждения.

Свойства флуорохромов (краситель, облад. флуоресцентными св-вами)

Коэффициент поглощения ( ε (cm-1M-1)) способность молекулы флуорохрома поглощать фотоны возбуждающего света (выше - лучше).

Квантовая эффективность (квантовый выход) отношение количества поглощённых фотонов к испущенным (выше - лучше)

Сдвиг Стокса разница между эненргией поглощённого фотона (hvEX ) и испущенного фотона (hvEM )

* Большие значения сдвига Стокса означают образование большого количества тепла в ходе вибрационных и ротационных изменений

* Низкая Квантовая эффективность означает большую вероятность безызлучательных процессов: тушение (квнчинг), внутренняя конверсия, переход в триплетное возбуждённое состояние

* Выцветание процесс потери флуоресцентных свойств, например в результате реакции с кислородом в возбуждённом состоянии.

Некоторые флуорохромы могут использоваться для фотоокисления (эозин)

Устройство эпифлуоресцентного микроскопа:

Освещение – от классического источника и ртутной лампы (пропущено через фильтр возбужденного света) сходится в дихроичном зеркале, а оттуда через барьерный фильтр – в окуляр.

Применяемые светофильтры:

• высокочастотный (high-pass) – пропуск УФ

• низкочастотный (Low-pass) – пропуск видимого и ИК света

• дихроичное зеркало – отражение УФ, пропускание видимого и ИК

• полосовой фильтр – по-разному

• низкочастотный блокирующий – пропуск ИК и видимого

Действие фильтров

• фильтр возбуждения – УФ пик

• полосовой барьерный – один цвет, слабый пик

• зеркало – 3 слабых пика

Спектры флуорохромов

• DAPI – фиолетово-голубой

• FITC – голубо-зеленый

• TEXAS RED – оранжево-красный

Выцветание

В зависимости от природы флуорохрома скорость выцветания будет различной:

* Синий флуоресцирующий белок (вариант GFP): 104-105 фотонов; 0.1-1 s

* Классический органический флуорохром (FITC): 105-106 фотонов; 1-10 s

* Современный флуорохром (Alexa 488): 8*105-2*106 фотонов; 80-200 s

* Квантовые точки (CdSe/ZnS): 108 фотонов; > 1000 minutes

Свойства флуорохромов

Антифейд (антивыцветалка)

PPG p-фенилендиамин (FITC, Texas Red) токсичен, низкая фотостабильность.

1mg/ml в 90% глицерине на буфере с pH > 8.0. Раствор не хранить!

NPG N-пропил-галлат (Texas Red, FITC) не токсичен, фотостабилен, 50mg/100ml в

2M Tris буфере, (подогреть для растворения) добавить 900 ml глицерина,

перемешать, хранить в темноте при температуре -20

DABCO 1,4-диазобицикло[2,2,2]-октан не токсичен, фотостабилен, возможно

использование in-vivo. Рабочая концентрация 0.1%, хранить в темноте

Аскорбиновая кислота 2mg/ml в ФБ или культуральной среде. Несовместима с

некоторыми клетками.

Trolux (производная витамина Е) может использоваться in-vivo

Vectashield (Vector)

SlowFade (Invitrogen/ Molecular Probes)

FluoroGuard (Bio-Rad)

Prolong (Sigma)

Некоторые флуорохромы и антифейды несовместимы, некоторым флуорохромам

ненужны антифейды.

Для фиксированных препаратов: микроскопию следует проводить как можно раньше,

Покровные стёкла должны быть герметизированы VALAP или лаком для ногтей,

Препараты хранить при пониженной температуре в темноте.

Автофлуоресценция (что светится без флуорохромов..)

* Остатки ароматических аминокислот — возб. дальний УФ

(200-340), синее свечение

* NADP NADPH Рибофлавин, FMN, FAD, катехоламины —

возб. ближний УФ, синее свечение

* Хитин - возб. УФ, яркое жёлтое свечение (488 нм)

* Хлорофилл — возб. синий, красный, красное свечение

* Липофусцин, некоторые другие липиды – возб. ближний УФ,

жёлто-зелёное (490нм) свечение

* Мёртвые клетки

* Фенолы, масла, сурфактант, альдегиды, мембраны клеток, целлюлоза

Автофлуоресценция может быть приобретена при обработке

* Фиксация в глютаральдегиде

* Фиксация в формалине и т.д.

В некоторых случаях автофлуоресценцию можно уменьшить

* Фиксация в ацетоне (нет автофлуоресценции) или

ацетон+метанол (небольшая автофлуоресценция )

* Использовать метку с другим спектром

* Выцветание автофлуоресценции при помощи УФ (не всегда)

* Для тканей, фиксированных формалином и глютаральдегидом

0.1% борогидрат.

Возможно применение судана чёрного, FeCl, CuSO4, OsO4

Метки для ДНК:

• PI (не проникает в клетки)

• DAPI (проникает в клетки)

• FITC (быстро выцветает, зависит от рН)

• производные родамина

Вопросы

1. Почему испускаемый флуорохромом свет не является монохромным (спектр

достаточно широк, хотя и имеет один максимум) ?

1. Возбуждающий свет не монохромен !

2. Температура выше абсолютного нуля

3. Молекула имеет несколько вибрационных о ротационных колебательных

подуровней

2. Имеет ли испускаемый при люминисценции свет преимущественное направление? Нет

3. Зависит ли спектр испускания от длины волны возбуждающего света? Нет

4. От каких характеристик зависит яркость флуорохрома ? От яркости падающего света, природы флуорохрома

5. От какого параметра наиболее сильно зависит яркость в эпи-флуоресцентном

микроскопе при одной и той же яркости возбуждающего света? От числовой апертуры

6. На что влияет размер апертурной диафрагмы в эпи-флуоресцентном микроскопе? На яркость

7. Какая особенность спектра ртутной лампы делает её удобной для флуоресцентной

микроскопии – УФ излучение, пики

8. На препарате сильно выражена автофлуоресценция, однако спектр вашего

флуорохрома достаточно отличается от неё. Кубик с барьерным фильтром какого типа

предпочтительнее использовать? С фильтром против автофлуоресценции (?)

9. Имеет ли значение конденсор и настройка проходящего света в случае эпи-

флуоресцентного режима исследования ? Конденсор – да, участвует в NA; настройка проходящего света – да, для суммации в зеркале с дополнительным освещением (?)

10. Скорость выцветания зависит от:

1. Интенсивности возбуждающего света да

2. Концентрации кислорода да

3. Температуры да

4. Среды в которую заключён препарат да

5. Флуорохрома да

11. Автофлуоресценцию каких веществ стоит ожидать от гистологического препарата

мозга крысы (фиксация в параформе)? остатки АК, катехоламин , параформ

12. Каким образом при помощи флуоресцентных красителей можно разделить живые и мёртвые клетки в культуре? автофлуоресценция, не отторгается-дохлые и т.д.

VI.

Флуоресцентная микроскопия – приложения

Основные группы флуорохромов:

• AMCA – 350 НМ – поглощение, 445 – эмиссия

• Cy3 Cy5 Cy5.5 Cy7 Cy3 максимум возбуждения 550 nm максимум испускания 570 nm, красный цвет; квантовый выход 0.38, коэффициент поглощения 250000. Cy5 максимум возбуждения 649 nm максимум испускания 670 nm, дальняя красная часть спектра; квантовый выход 0.28, коэффициент поглощения 250000.

• Флуорохромы Alexa:

* Высокий коэффициент поглощения и квантовая эффективность

* Большая фотостабильность (Alexa 488 в сравнении с флуоресцином)

* Совместимы с большинством источников света и фильтрами

* Растворимы в воде, малая чувствительность к рН

* Высокая цена

* Совместимы не со всеми веществами против выцветания и не со всеми средами для заключения

Флуорохромы Alexa являются сульфонированными аналогами кумарина, родамина, ксантина

(напр. флуоресцеин), и цианиновых красителей.

Присоединение серы создает отрицательный заряд и увеличивает гидрофильность.

Повышается стабильность, яркость, уменьшается зависимость от рН.

Однако увеличивается стоимость.

• Флуорохромы DyLight – позиционируются как более дешевые аналоги Alexa

• Флуорохромы BODIPY - Высокий квантовый выход (до 1.0, даже в воде). Однако есть значимое тушение пр конъюгации с белками. Отсутствие заряда позволяет использовать эти флуорохромы для окраски в живых клетках. Также часто используются для окраскт липидов.

Конъюгация флуорохромов с белками

-идет за счет групп N=C=S (изотиоцианат) +NH2, C=O + NH2, SO2Cl+NH2

Флуорохромы для ДНК:

• Hoechst 33342

• Hoechst 33258

• Этидий бромид - окрашивает ДНК и РНК, высокий фон.

• Акридин оранжевый - ДНК,РНК разный спектр для ДНК и РНК, для мёртвых и живых клеток

• SYBR Green

• DAPI - избирательно AT участки двунитевой ДНК, проходит через мембрану живых клеток

• 7-AAD - избирательно GC, плохо проходит через мембраны живых клеток

• PI - не проходит через мембрану живых клеток, красит двунитевые участки РНК

• SYTO - Проходят через мембраны живых клеток

• SYTOX – Не проходят через мембраны живых клеток

• Цианиновые красители TOTO LOLO YOYO BOBO и т.д.

Можно использовать одновременно несколько разных меток

Квантовые точки - фрагменты проводника/полупроводника, огр. по трем простр. измерениям и сод. электроны проводимости

Не чувствительны к pH и ионам, высокая квантовая эффективность, практически отсутствующее выцветание, узкий спектр испускания.

Возможно возбуждение всех квантовых точек одной длиной волны (УФ или 405nm). Химически инертны (до тех пор, пока не повреждена оболочка). Размер соответствует казмеру белка (15-18 нм).

Размер нанокристалла (ядро, мембрана, Ig, вещества на мембране, стрептавидин) определяет цвет

Размер можно менять от ~2 до 10 нм (±3%)

Распределение размеров определяет ширину спектра

Латексные микросферы

Возможен различный размер, спектр поглощения и возбуждения. Могут использоваться для последующей электронной микроскопии.

Применяются для: калибровки и проверки микроскопа, как метка транспорта,

как метка для малочисленных рецепторов.

Трейсерные красители (на нервной ткани) – 2 недели выдержки

• Dil (зеленый)

• DiD (красный)

Иммунофлуоресценция – метод определения кол-ва и (или) распределения какого-л. антитела или антигена в тканевом срезе. Антитела маркируются флуоресцентным красителем, а затем воздействуют на ткань, срез которой изучают в УФ микроскопе.

• прямой метод – меченое антитело садится на антиген

• косвенный метод – на антиген садится не меченое первичное АТ, к которому прикрепляются вторичные меченые АТ

Дополнительные методики

• авидин-биотиновый метод – косвенный иммунофлуоресцентный метод, при котором в качестве метки ко вторичным АТ пришивается биотин, авитин и флуорохром

• ферментативное осаждение – косвенный ИФ метод, при котором в качестве метки ко вторичным АТ пришиваются биотин, авидин и фермент, а потом вливается субстрат. Образуется нерастворимый флуоресцирующий осадок.

Авидин может быть замещен на стрептовидин, нейтравидин.

Протокол непрямой иммунофлуоресценции.

1*. (Депарафинизация и регидратация для объектов, залитых в парафин (2 ксилола, регидратация через

батарею спиртов), промывка в буфере 3 раза по 5 минут).

2*. (Подавление автофлуоресценции, например 10 минут 0.1% борогидрат, промывка в буфере 3 раза по 5 минут.)

3*. (Демаскирование антигена, например обработка ферментами или высокой температурой )

4. Промывка в буфере 3 раза по 5 минут.

5. Блокировка неспецифического связывания - 30 мин. В разведённой нормальной сыворотке животного в котором получены вторичные антитела (возможно применение веществ способствующих проникновению сыворотки в ткань напр. сапонин, Triton-X 100 или ферменты).

6. Убрать излишек блокирующего раствора, не промывать.

7. Инкубация с первичными антителами, разведёнными в буфере с 1-2% нормальной сыворотки

(возможно применение веществ способствующих проникновению сыворотки в ткань).

8. Промывка в буфере 3 раза по 5 минут.

9. Инкубация с разведёнными вторичными антителами (37°C, в темноте).

10. Промывка в буфере 3 раза по 5 минут. (с затенением).

11. Заключение препарата в среду (глицерин, мовиол, возможно использование DAPI, веществ,

препятствующих выцветанию,препарат гермитизируется VALAP или лаком для ногтей)

Контроль при ИФЛ

Контроль:

* Препарат без обработки, заключённый в среду (автофлуоресценция)

* Негативный — замена первичных антител нормальной сывороткой

* Позитивный – тот же протокол на образце, в котором изучаемый антиген доподлинно присутствует

* Негативный — проверка изотипа — замена первичного антитела на другое (из того же вида животного)

Практическое замечание:

ИФЛ зависит от большого числа параметров, наилучший подход — найти в литературе подходящий метод и только потом модифицировать его под свой материал.

Это поможет избежать многих известных проблем, например выявление актиновых филаментов после фиксации в метаноле, изучение структуры микротрубочек после фиксации в формалине, и т.д.

Достоинства и недостатки ИФЛ

Достоинства

* Обработка быстрее и проще

* Часто используются срезы с криотома

* Залитые в парафин срезы также могут использоваться

* Нет необходимости в использовании хромогена

* Возможно рутинное использование 3х меток одновременно (до 7 при специальной обработке)

* Препараты могут быть использованы для оптической окраски и электронной микроскопии (иммунофлуоресценция-иммунозолото, фотоконверсия, квантовые точки, и т.д.)

Недостатки

* Специальное оборудование для визуализации

* Препараты недолговечны в виду выцветания

* Требуется заключение в водую среду (для большинства флуорохромов)

* Необходим опыт (автофлуоресценция и т.д.)

Использование нескольких меток:

Перед использованием нескольких меток:

* Проверьте каждую метку по отдельности и взаимопроникновение при использовании кубиков под каждый из них

* Проверьте, какая метка Вам наиболее важна, используйте для неё наилучший флуорохром

* Первичные антитела должны быть из разных животных! (возможно использование специальных методов Zenon, direct labeling, M.O.M.)

Выбор флуорохрома:

* Возбуждение или испускание разных флуорохромов должны быть хорошо разделены

* Желательны флуорохромы с узкими спектрами

* Под эти флуорохромы на микроскопе должны быть установлены соответствующие кубики (флуоресцентный режим)

* Спектры возбуждения должны соответствовать установленным лазерам (конфокальный режим)

Выбор нескольких флуорохромов:

• первичный – DAPI/UV (УФ)

• вторичный – FITC (зеленый)

• третичный – TRITC (желтый)

• четвертичный – IR (красный)

Выделение клеточных компонент:

• ядрышки - SYTO RNASelectTM green fluorescent cell stain

• ЭПР - ER tracker green, ER tracker red

• аппарат Гольджи – NBD C6-ceramide

• лизосомы – LYSO Tracker Green

• актин – родамин+фаллоидин

• тубулин – Tubulin tracker

Качество изображения

* Выбор флуорохрома

* Концентрация флуорохрома

* Яркость возбуждающего света

* Лампа осветителя

* Длина волны возбуждающего света

* Блокирующий фильтр

* Объектив NA, тип, аберрации, иммерсия

* Увеличение

* Тушение флуорохрома

* Выцветание

* Автофлуоресценция

* Спектр пропускания оптической системы

* Деградация флуорохрома

* Среда (pH, T, растворитель, и т.д.)

* Рассеяние

* Детектор

* Артефакты изображения (пыль, мембраны клеток, и т.д.)

Вопросы.

1. Каким образом возможна конъюгация флуорохрома с определённым белком ? Через связи N=C=S, C=O, SOCl2 и т.д.

2. Чем различаются различные флуорохромы для выделения ДНК ? Спектром поглощения/испускания, возможностью исп. для РНК, для ДНК в каком состоянии подходит, для мертвых или живых клеток и т.д.

3. Каким образом при помощи флуоресцентных красителей можно разделить живые и

мёртвые клетки в культуре? Проходящими/непроходящими через мембрану живых клеток, отторгающиеся или нет

4. Что означает термин ≪взаимопроникновение каналов≫ в флуоресцентной

микроскопии ? Размытие флуоресценции из-за «наезжания» испускания одного флуорохрома на второй

5. Какие особенности спектра поглощения и испускания имеют квантовые точки ? Ширину спектра определяет размер, узкий спектр испускания, высокая квант. эффективность, возможно возбуждение всех квантовых точек одной длиной волны (УФ или 405nm).

6. В чем преимущество метода непрямой ИФЛ перед прямой ИФЛ ? Можно использовать доп. методики, большая точность и связываемость

7. Опишите авидин-биотиновый метод, в чем его преимущества ? непрямая ИФЛ с прикреплением авидина и биотина, большая связываемость антигена

8. Какие контрольные эксперименты необходимы при ИФЛ, какие возможны ?

* Препарат без обработки, заключённый в среду (автофлуоресценция)

* Негативный — замена первичных антител нормальной сывороткой

* Позитивный – тот же протокол на образце, в котором изучаемый

антиген доподлинно присутствует

* Негативный — проверка изотипа — замена первичного антитела на

другое (из того же вида животного)

9. Какие особенности флуорохромов надо учитывать при использовании нескольких

меток ? Спектры испускания и поглощения, связываемость, проверить важность меток, узкие спектры, соотв. кубики или лазеры в микроскопе

10. Что нужно учитывать при выборе первичных и вторичных антител при ИФЛ для

нескольких антигенов ? первичные АТ от разных животных, важность метки, проверка каждой по отдельности

11. Что нужно учитывать при использовании флуорохромов, специфических для

определённых клеточных компонент ? как связывается, какой спектр поглощения/испускания, не выбрать одинаково светящиеся и т.д.

12. Какие параметры влияют на качество флуоресцентных изображений ?

* Выбор флуорохрома

* Концентрация флуорохрома

* Яркость возбуждающего света

* Лампа осветителя

* Длина волны возбуждающего света

* Блокирующий фильтр

* Объектив NA, тип, аберрации, иммерсия

* Увеличение

* Тушение флуорохрома

* Выцветание

* Автофлуоресценция

* Спектр пропускания оптической системы

* Деградация флуорохрома

* Среда (pH, T, растворитель, и т.д.)

* Рассеяние

* Детектор

* Артефакты изображения (пыль, мембраны клеток, и т.д.)

VII.

Специальные методики флуоресцентной микроскопии

Физиологические флуорохромы

Физиологические флуорохромы — качество

* Свободное и связанное состояние имеют разную КЭ

* Выявляются только локальные изменения яркости флуорохрома (возможно за счёт разной концентрации)

Ратиометрические флуорохромы — качество и количество

* Свободное и связанное состояние имеют разные спектры поглощения и/или испускания

* Соотношение сигналов указывает на равновесное состояние связанного и свободного флуорохрома

* Возможно вычислить концентрацию интересующего иона

Ca++ ратиометрические - FURA-2, INDO-1,

физиологические - FURA RED

pH ратиометрические и физиологические BCECF, SNARF, SNAFL

Потенциал-чувствительные DiBAC4(3), ANNINE-6plus, di-4-

ANEPPS

[Ca2+]i=Kd(F−F min)/(F max−F)

Kd – константа диссоциации флуорохрома – зависит от конц-ии

Fmin флуоресценция без Ca2+ - зависит от конц-ии

Fmax флуоресценция при насыщении Ca2+ - зависит от конц-ии

ΔF/F=(F-F0)/F0

- Относительное изменение флуоресценции (не зависящее от концентрации)

F0 – изначальная флуоресценция (до воздействия)

Δ[Ca2+]i=Kd*( ΔF/ F )/( ΔF/ F max)

Для случая, когда ΔF/F<<(ΔF/F)max

Ратиометрия

-измерение соотношений концентрации красителя и Ca2+

R=F1/F2 – F1 и F2 зависят от длины волны возбуждающего света. Изменение соотношения (концентрации Ca2+) не зависит от концентрации красителя.

Флуоресцентные белки

• Зелёный флуоресцентный белок (GFP) - впервые выделен из медузы Aeqourea victoria

Два пика возбуждения 395 и 475nm, излучение 508nm