Типы объективов фирмы Лейка

C PLAN планахромат, не рекомендуется для использования с флуоресценцией

N PLAN планапохромат

N PLAN L планапохромат, большая рабочая дистанция

PL FLOUTAR планапохромат флуотар (подходит для флуоресцентной микроскопии)

PL FLOUTAR L планапохромат флуотар, большая рабочая дистанция

HCX PL APO планапохромат для работы с конфокальным микроскопом

HCX PL APO L U-V-I планапохромат для работы с конфокальным микроскопом, большая рабочая дистанция,

УФ — видимый — ИК

Проходящий свет, тёмное поле, флуоресценция и ДИК микроскопия обычно не упоминаются

BD - тёмное поле при эпиосвещении

PH - фазовый контраст

L - большая рабочая дистанция

RC - контраст отраженного света

POL,P - Объективы без напряжения оптических элементов для поляризованного света

LMC - контрастирование по хоффману (модуляционный контраст)

/ - Объектив не подходящий для эпииллюминации

Как использовать оптические инструменты?

Никогда не дотрагивайтесь до оптических поверхностей. Просветление

на линзах очень легко повреждается механически и химически.

■ Никогда не прилагайте излишнюю силу к ручкам фокусировки, конденсору и другим частям микроскопа.

■ Никогда не роняйте и не прикладывайте продольных и поперечных усилий к оптическим компонентам.

■ Не позволяйне иммерсионному маслу высыхать на передней линзе объектива.

■ Будте особенно аккуратны с объективами инвертированного микроскопа. Не позволяйте жидкостям попадать на объектив или револьвер объективов.

■ Для протирки после иммерсии используйте только специальную ткань.

■ Всегда накрывайте неиспользуемый микроскоп.

■ Всегда закрывайте неиспользуемые порты микроскопа.

1. Геометрическая оптика

• При монохроматическом освещении и использовании тонкого препарата при открытой апертурной диафрагме невозможно точно сфокусировать микроскоп. Какой тип(ы) аберрации могут присутствовать ? монохроматическая

• При монохроматическом освещении невозможно сфокусировать края изображения. Какой тип(ы) аберрации присутствует ? Как можно скорректировать микроскоп для их уменьшения? Кома, сферическая абберация. Прикрываем апертурную диафрагму

• При монохроматическом освещении невозможно одновременно сфокусировать центр и края изображения. Какая дисторсия присутствует? Кривизна поля

2. Объективы

• Числовая апертура объектива это мера угла, образуемого крайними входящими в объектив лучами. (NA=n*sinθ)

• Вам необходимо исследовать точные размеры клеток по всему полю зрения в белом свете. Какой объектив Вы используете? Планахромат

• Вам необходимо исследовать очень тускло флуоресцирующий объект. Какой тип объектива предпочтителен? Флуорит, также желательно взять объектив с большой NA

• Для освещения препарата используется УФ (355нм) свет в режиме эпи-иллюминации. На что следует обратить внимание при выборе объектива, иммерсионного масла? Объектив должен пропускать УФ, иммерсионное масло должно пропускать УФ, но не флуоресцировать в нем

• Для электрофизиологического исследования Вы хотите использовать инфракрасный осветитель и видеокамеру, какой конструкционный тип объектива лучше выбрать, на что обратить внимание? Объектив должен пропускать ИК свет, и не должно быть покровного стекла (при этом сильно теряется разрешение, поэтому должна быть хоть какая-то иммерсия, неплохо было бы использовать погруженный объектив)

• Вы собираетесь исследовать ультраструктуру цитоскелета клетки, какой объектив следует выбрать? Иммерсионный план-апохромат

4. Конденсоры

• Для объективов < 20x следует использовать конденсор с NA меньше 0,5

• Для больших увеличений следует использовать конденсор с NA больше 0,5

• При этом, предпочтительно, чтобы NA конденсора был равен NA объектива

5. Окуляры

• Вы используете объектив 60х с NA=0,9. Вам необходимо получить максимальную детализацию объекта, избежав «пустого увеличения». Какой/какие из окуляров Вы выберете? (2.5х 5х 7х 10х 15х 20х 25х)

• При тех же условиях какие окуляры следует выбрать, если бинокулярная насадка даёт увеличение 1.5x ? (2.5х 5х 7х 10х 15х 20х 25х)

6. При настройка микроскопа по методу Кёллера прежде всего надо:

• Закрыть все диафрагмы

• Открыть все диафрагмы

• Увеличить яркость осветителя

• Поместить препарат и сфокусировать микроскоп

• Отцентровать лампу

• Сфокусировать изображение осветителя на апертуру конденсора

III.

Конструктивная интерференция – при совпадении волн в фазе (разность равна 0) получается волна с амплитудой вдвое большей исходной.

Деструктивная интерференция – при сложении волн в противофазе (разность фаз=П) получается волна с амплитудой равной разности амплитуд исходных волн.

Дифракция – способность света огибать препятствия. Т.к. свет – это эл/маг. волна - образуются главный и побочный максимумы. Можно применить функцию распределения (главный максимум=84%). Дифракционная картина=диск Эйри. Главный максимум увеличивается при приближении к щели источника света, при приближении к нему линзы, при пропускании света через 2 линзы подряд, при увеличении апертуры.

Формирование изображения

Длина оптического пути (ДОП = nt). Для формирования изображения за счёт интерференции ДОП должна быть одинаковой для интерферирующих лучей, а источник света должен быть частично когерентным.

ДОП=n1⋅t1*n2⋅t2*n1⋅t3

При увеличении апертуры сферический фронт волны более точно сходится в одной точке, и дифракция уменьшается.

При прохождении света после щелей через линзу образуются фокусы 0 (прямое направление), 1 и т.д. порядков (уже отклоненные лучи), а на экране после этого получаются полосы 0, 1 и т.д. порядков.

Разрешение микроскопа

Разрешение – это способность опт. прибора воспроизводить изображение близко расположенных объектов.

d=1,22λ/2NA

NAконденсора>=NAобъектива->NAсистемы=NAобъектива

Критерий Релея – два точечных ист. света различимы в окуляре, если дифр. максимум одного из них накладывается на дифр. минимум другого.

При уменьшении контраста и увеличении частоты четкость изображения падает.

NA=NA(obj.)+NA(kond.)

Открытая апертурная диафрагма – высокое разрешение, но низкий контраст,

нескомпенсированные аберрации, побочный свет, котороый может попасть в объектив.

Закрытая апертурная диафрагма – высокий контраст, компенсация аберраций, но

низкое разрешение и низкая яркость.

Сферическая аберрация достигается коррекцией объективами преломления имерсии и толщины покровного стекла (чем оно тоньше, тем лучше).

Глубина резкости – это расстояние между передней и задней границами резко изображенного пространства, измеренное вдоль оптической оси в пределах кот. объекты съемки на снимке отображаются безусловно резко. Уменьшается при увеличении дифракции (уменьшении главного максимума, размытии). Чем больше числовая апертура, тем меньше глубина резкости.

Z= nλ/NA^2 * ne/M⋅NA, где

e - разрешение детектора

1. К чему приведёт уменьшение диаметра апертурной диафрагмы в правильно настроенном по Кёллеру микроскопе?

• Увеличение разрешения

• Уменьшение разрешения

• Увеличение контраста

• Уменьшение контраста

• Уменьшению числовой апертуры системы

• Увеличению числовой апертуры системы

• Уменьшению глубины резкости

• Увеличению глубины резкости

• Уменьшению яркости

• Увеличению яркости

• Уменьшению аберраций

• Увеличению аберраций

2. Что будет находиться в геометрическом фокусе объектива?

Фокусы различных порядков дифракции

3. К чему приведёт использование покровного стекла, не соответствующего

выбранному объективу по толщине?

К сферическим абберациям

4. Вы исследуете достаточно объёмный объект (нервная клетка с отростками) и получаемое изображение имеет слишком малую глубину фокуса. Каким способом можно улучшить изображение.

Прикрыть апертурную диафрагму

5. На изображении препарата видна пыль, но сам препарат чистый — назовите плоскости, в которых, при правильно настроенном микроскопе, может находиться пыль.

Полевая диафрагма, нижняя линза окуляра софокусны с препаратом, поэтому, если на них будет пыль, то мы ее увидим

6. Качество наблюдаемого изображения не удовлетворительно, при просмотре плоскости осветителя видна пыль — назовите плоскости, которые нужно проверить на наличие пыли.

На лампе

7. Волновая оптика

• Длина оптического пути зависит от расстояния, которое проходит луч света

• Длина оптического пути зависит от коэффициента преломления

• Волны, прошедшие разный оптический путь будут всегда отличаться по фазе

8. Согласно критерию Релея 2 точечных объекта можно различить, если образуемые ими в плоскости изображения диски Айри находятся на расстоянии:

• Половины длины волны

• Длины волны

• Первого дифракционного минимума (кольца)

• Второго дифракционного максимума (кольца)

9. Известно, что для NA конденсора >= NA объектива, размер диска Айри = λ/2NA, а первый максимум находится на расстоянии в 1.22 диаметра диска Айри. Рассчитайте каков теоретический предел разрешающей способности микроскопа, NA объектива которого = 1.3, NA конденсора =1.4, использующего монохроматическое освещение с длиной волны

546nm?

• ~0,16 mkm

• ~0,21 mkm

• ~0,26 mkm

• ~0,32 mkm

В формуле берем за числовую апертуру систему. Если числовая апертура объектива больше числовой апертуры конденсора, то берем сумму апертур. Если числовая апертура конденсора больше числовой апертуры объектива, то берем числовую апертуру объектива

10. Будет ли возможным детектировать объект, размеры которого меньше предела разрешающей способности?

Да

11. Глубина резкости микроскопа (Z) зависит от:

• Длины волны – чем больше длина волны, тем меньше глубина резкости

• Длины волны – чем меньше длина волны, тем меньше глубина резкости

• Коэффициента преломления иммерсионной жидкости (n) - чем больше n , тем меньше глубина резкости

• Коэффициента преломления иммерсионной жидкости (n) - чем больше n , тем больше глубина резкости

• Числовой апертуры объектива – чем больше числовая апертура тем больше глубина резкости

• Числовой апертуры объектива – чем больше числовая апертура тем меньше глубина резкости

12. Вам необходимо получить максимальную разрешающую способность от оптической системы микроскопа. Для этого Вы используете:

• Полихроматическое освещение (белый свет)

• Монохроматическое освещение с большой длиной волны (красное)

• Монохроматическое освещение с малой длиной волны (синее)

• Объектив с высоким значением числовой апертуры

• Объектив с низким значением числовой апертуры

• Конденсор с большим, чем у объектива, значением числовой апертуры

• Конденсор с меньшим, чем у объектива, значением числовой апертуры

• Конденсор со значением числовой апертуры, примерно равным значению

• числовой апертуры объектива

• Приоткроете полевую диафрагму

• Прикроете полевую диафрагму

• Приоткроете апертурную диафрагму конденсора

• Прикроете апертурную диафрагму конденсора

IV.

Темнопольная микроскопия – это вид опт. микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом.

S-волна, surround wave – нулевой порядок, волна, прошедшая через объект не претерпев дифракции

D-волна, diffracted wave – волна, претерпевшая дифракцию на объекте и изменившая направление и/или фазу

В темнопольной микроскопии оптической системой собираются только D-волны. За счёт лучшего контраста становится возможной детекция лизосом, микротрубочек (в 20 раз менее дифракционного предела) однако только детекция, разрешение не увеличивается.

Освещение по Рейнбергу

- когда свет проходит через цветной светофильтр (т.н. оптическое окрашивание), цветной вариант микроскопического метода темного поля. Для S и D волн – свои цветофильтры.

Фазовый контраст

Амплитудный объект – при прохождении через него свет меняет амплитуду.

Фазовый объект – свет меняет фазу. Фаза объектного света S отстает на λ/4 от фоновой D =>контраст.

Достигается фазовым кольцом на объекте (либо выпуклое, либо вдавленное)+фазовым кольцом на конденсоре.

Настройка фазового контраста:

Используйте объектив для фазового контраста

● Произведите настройку освещения по Кёллеру

● Положите ≪фазовое кольцо≫ на переднюю апертуру конденсора

● Используйте линзу Бертранда, или выньте окуляр.

● Совместите изображение колец.

● Установите окуляр и приступите к микроскопированию

Фазовый контраст показывает разницу в длине оптического пути, а не отдельно в толщине или преломляющей способности исследуемого объекта!

Артефакты фазового контраста:

• гало - на фазовое кольцо попадают и D-волны

• затенение - разная степень диффракции от центра и периферии объекта

Поляризация:

-линейная:λ/2

-круговая λ/4

-эллиптическая λ/8

Двойное лучепреломление – эффект расщепления в анизотропных средах луча света на две составляющие (обыкновенный и необыкновенный лучи). Наблюдается в кристаллах С=С=С...

Лучи по-разному поляризованы, один распр. медленно, а второй – быстро. В результате – окраска тонких предметов (волос) радужно.

Поляризационная микроскопия – с использованием анализаторов и поляризаторов. Позволяет получить окрашенные части изображения (нужная длина волны – красные филаменты и т.д.) без использования красителей.

Таблица Мишеля Леви – зависимости двойного лучепреломления от толщины среза в мм в порядках.

Дифференционно-интерференционный контраст (ДИК)

Из-за возникающей разницы в фазе получается псевдо 3D изображение. Используются призмы Волластона – поляризатор и объектив (до и после препарата).

Метод показывает первую производную разницы длин оптического пути

Разрешение при этом методе не одинаково по осям.

Настройка микроскопа для DIC контрастирования

1. Настроить освещение по Кёллеру

2. Установить поляризатор и анализатор, поворачивая поляризатор, добейтесь его максимального перекрестия с анализатором. Поле должно быть тёмным.

3. При осмотре задней апертуры объектива должны быть виден тёмный, вертикально ориентированный крест

4. Вставить призму, находящуюся за объективом (или объектив с призмой). На задней апертуре объектива должна наблюдаться единственная наклонённая под 45˚ тёмная полоса

5. Уберите призму объектива, вставьте призму конденсора, убедитесь, что на задней апертуре объектива наблюдается единственная наклонённая под 45˚ тёмная полоса, совпадающая с наблюдаемой ранее

6. Установите призму объектива, вставьте окуляр, приступите к микроскопированию, при необходимости добейтесь необходимого контрастирования, смещая призму объектива

Модуляционный контраст Хоффмана

Может использоваться на материалах с двойным лучепреломлением (пластиковых чашках).

На конденсор ставится щелевая апертура, а на объектив – задняя апертура. На плоскости изображения наблюдаются разные зоны пропускания от 0% до 100%.

Сравнение методов