ОСНОВЫ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ
©по мотивам материалов П.А.Зыкина, Д. Сергеевой, К.Левчук, Е.Романовой, А.Давыдовой http:// wikipedia.org
Техники микроскопии: I.
Природа света – поперечная эл/маг волна . Колеблются векторы Е и В электрической и магнитной напряженности. Энергия света=hv/λ
Частота видимого света – от 400 до 700 нм. До него – ионизирующее излучение (0,01-1 нм), рентген (1-100 нм), УФ (100-400 нм); после – ИК (1 мм-1 см), радио (1м-1 км).
Свойства света:
-
Каждый цвет имеет определенную длину волны. Энергия света определенной длины волны=Е= hv/λ.
-
Световая волна имеет амплитуду. На ней основано понятие интенсивности. I=A^2, Контрастность=C=ΔI/I(фона).
-
Когерентные волны – однофазные, могущие интерферировать.
-
Монохроматичность света – равенство длин всех волн в нем. Фаза может различаться!
-
Поляризация света – колебание всех волновых векторов в нем в определенно плоскости или описание ими окружности (круговая поляризация) за период распространения волны.
-
Коллимированность – однонаправленность светового пучка.
Глаз – детектор световых волн. Характеристики глаза как оптического прибора:
-
Разрешение - характеристика, определяющая при каком минимальном расстоянии между объектами они еще различимы как два разных. Наилучшее разрешение 1-2' в зоне 1-1,15*.
-
Поле зрения – диапазон пространства, в котором еще можно увидеть объект. Общее поле зрения глаза – 125* по вертикали и 150* по горизонтали. Область желтого пятна – 8* по горизонтали и 6* по вертикали, вся остальная часть поля служит для грубого ориентирования в пространстве.
-
Чувствительность – минимальная интенсивность света, при которой регистрируется объект. Обеспечивается чувствительными клетками – палочками и колбочками.
-
Динамический диапазон – диапазон темных или светлых тонов, которые начиная с некоторого значения кажутся черными или белыми.
-
Спектральная характеристика – чувствительность глаза к различным длинам волн. Наиболее глаз чувствителен к излучению с длиной волны 555 нм днем (желто-зеленая часть спектра) и 515 нм в сумерках. Видимая область спектра – 380-780 нм. Количественное соотношение поглощения красной:зеленой:голубой волн примерно равно 12:6:1.
-
Временное разрешение – минимальное время, когда два объекта воспринимаются как разные.
Цветовые модели включают 2 палитры – аддитивную (RGB) и субстрактивную (CMYK). Базовые цвета RGB – красный, зеленый и синий, в смешении получают белый, желтый, фиолетовый и голубой цвет. Эта палитра – для флуоресцирующих объектов:мониторов, прозрачных пленок и т.д.
Базовые цвета CMYK – желтый, голубой и фиолетовый. Получают красный, зеленый, черный(темно-коричневый) и синий.
Не все цвета аддитивной палитры можно воспроизвести в субстрактивной палитре!
Характеристики источников света:
-
Ртутные лампы – 300 ч жизни, больше в УФ области, 5 пиков, дорогие
-
Ксеноновые лампы – 300 ч жизни, больше в ИК области, пики в ИК области, дорогие
-
Металл-галогеновые – 3000 ч, различно, менее дорогие
-
Галогеновые – 1000 ч, ИК область, нет пиков, недорогие
-
Накаливания – 1500 ч, ИК область, нет пиков, недорогие
-
LED – 10000ч, есть пики, низкая яркость.
Взаимодействие света с живыми клетками.
-
УФ:разрушает ковалентные связи, создает свободные радикалы. Средства борьбы:УФ-блокирующие фильтры, уменьшение яркости, увеличение объема среды и скорости перфузии, добавление аскорбиновой к-ты, сукцината, каталазы, глюкозы, понижение концентрации кислорода.
-
ИК:избыточный нагрев вплоть до денатурации. Средства борьбы:ИК-блокирующие фильтры (горячее зеркало, CuSO4), увеличение объема среды и скорости перфузии
Фильтры:
-
Нейтральные – нет спектральной фильтрации
-
Цветные стекла – широкая спектральная фильтрация, низкая цена, длительное время жизни, средняя износостойкость
-
Интерференционные – узкая спектральная фильтрация, средняя цена, среднее время жизни, низкая износостойкость. Принцип действия:2 металлические пластины с диэлектриком толщиной в ½ длины волны посередине. Входящий свет неподходящей длины волны отражается, а требуемый проходит дальше, становясь монохроматичным и удваиваясь.
Оптическая Плотность фильтра = ОП=log10(1/T)
Преломление и отражение света.
Закон преломления:n(куда падает)*sin(падающего)=n(откуда падает)*sin(преломленного)
n=c/V(света в среде)
Если коэффициент преломления материалов одинаков, то один не видно в другом (покровное стекло в иммерсионном масле)
Призма разлагает свет, т.к. разный коэффициент преломления для каждой длины волны.
Число Аббе – отношение дисперсии (разница преломления от длины волны) к преломляющей способности.
Геометрическая оптика.
Луч – абстрактный объект, перпендикулярный фронту световой волны.
Увеличение линзы – отношение расстояний от линзы до изображения к от линзы до предмета.
3 луча:через центр линзы, и 2 – параллельные ГОО, падающие в фокус.
Формула простой линзы: 1/f=1/a+1/b
Если объект:
-
на огромном расстоянии – точка
-
на расстоянии больше 2F – уменьшенное перевернутое изображение
-
на расстоянии 2F – равное перевернутое
-
на расстоянии между F и 2F – увеличенное перевернутое
-
на расстоянии F – ничего (лучи не сходятся)
-
на расстоянии меньше F – мнимое увеличенное
Реально после линзы изображение проходит через хрусталик, который на сетчатке дает действительное перевернутое увеличенное изображение.
В микроскопе изображение сначала формирует объектив, потом окуляр, а потом мнимое увеличенное изображение обрабатывает хрусталик.
Вопросы:
1. Спектр осветителя, использующего лампы накаливания или галогенные лампы отличается:
-
Непрерывностью в диапазоне от ИК до УФ
-
Значительным излучением в ИК диапазоне
-
Значительным излучением в УФ диапазоне
-
Зависимостью спектрального максимума излучения от напряжения
2. Электродуговые лампы (Xe, Hg)
-
Ртутные лампы имеют значительное излучение в ИК диапазоне
-
Ксеноновые лампы имеют значительное излучение в ИК диапазоне
-
Ртутные лампы имеют значительное излучение в УФ диапазоне
-
Ксеноновые лампы имеют значительное излучение в УФ диапазоне
-
Ртутные лампы имеют значительные пики, один из которых 546 нм
-
Ксеноновые лампы имеют значительные пики, один из которых 546 нм
3. Повреждающее действие света
-
Основное повреждающее (фототоксическое) действие УФ излучение вызывает из-за разрыва ковалентных связей и образования свободных радикалов
-
Основное повреждающее (фототоксическое) действие ИК излучение вызывает из-за разрыва ковалентных связей и образования свободных радикалов
-
Основное повреждающее действие ИК излучение вызывает из-за тепловой денатурации белков
-
Основное повреждающее действие УФ излучение вызывает из-за тепловой денатурации белков
4. Светофильтры (впишите названия фильтров)
-
Для регуляции потока света от Xe,Hg ламп используются нейтральные фильтры
-
Для выделения узкой полосы спектра (монохроматического света с точностью до 1 нм) из излучения источника используются интерференционные фильтры
-
Учитывая комплиментарный характер субстрактивных цветов, для лучшей контрастности полупрозрачного образца, окрашенного в синий цвет, следует использовать желтый светофильтр
-
Человеческий глаз лучше всего воспринимает монохроматический свет желто-зеленого цвета ( ~555 нм)
5. Использование цвета
-
При просмотре изображения на мониторе компьютера используется аддитивная палитра
-
При публикации изображений на бумаге используется субстрактивная палитра
-
Все цвета из аддитивной палитры могут быть воспроизведены при помощи субстрактивной палитры (Нет)
6. Преломление
-
Покровное стекло нельзя разглядеть когда оно помещено в сосуд с иммерсионным маслом
-
Угол преломления луча зависит только от коэффициентов преломления двух сред
7. Геометрическая оптика
-
Увеличение тонкой двояковыпуклой линзы зависит только от её фокусного расстояния (Нет)
-
Условием создания увеличенного изображения объекта на экране за тонкой двояковыпуклой линзой является расположение объекта на расстоянии от F до 2F от линзы и экрана на расстоянии больше 2F от линзы с противоположной стороны
-
Условием формирования изображения на сетчатке глаза является расхождение оптических лучей
-
Условием видимости мнимого изображения при использовании тонкой двояковыпуклой линзы является расположение объекта на расстоянии от F до 2F от линзы
II.
Аберрации.
-это ошибки, погрешности изображения в оптической системе, вызываемые отклонением луча от направления, по которому он должен был бы идти в идеальной оптической системе.
Виды:
-
Хроматическая – паразитная дисперсия света, проходящего через оптическую систему. Изображения предмета в разных цветах не совпадают в пространстве изображений. Исправление – склейкой (ахроматом) – системой линз со сближенными фокусами лучей , разных цветов.
-
Сферическая аберрация – нарушение гомоцентричности пучков лучей от точечного источника, прошедших через оптическую без нарушения симметрии строения этих пучков. Исправление – применение оптических стекол с высокими показателями преломления, диафрагмирование объектива
-
Кома – каждый участок оптической системы, удаленный от ее оси на расстояние d (кольцевая зона), дает изображение светящейся точки в виде кольца, радиус которого тем больше, чем больше d; может рассматриваться как сферическая аберрация лучей, проходящих через оптическую ось системы.
-
Астигматизм – изображение точки, находящейся вне оси, и образуемое узким пучком лучей, представляет собой два отрезка прямой, расположенных перпендикулярно друг другу на разных расстояниях от плоскости безаберрационного фокуса. Корректируется подбором кривизны поверхностей и т.д.