Новиков Д.К. Медицинская микробиология

При генетической рекомбинации вирусов может быть обмен полными генами

(межгенная рекомбинация), или участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация).

При заражении клетки одновременно несколькими вирусами возможны различные виды взаимодействия – множественная реактивация, перекрестная реактивация, рекомбинация, пересортировка генов, гетерозиготность. При взаимодействии на уровне продуктов генов (т.е. фенотипических проявлений) возникают негенетические взаимодействия: комплементация, фенотипическое смешивание.

Одним из видов рекомбинации является пересортировка (реассортация) генов. Она наблюдается при генетических перестройках у вирусов, имеющих сегментированный геном. Например, рекомбинантов вируса гриппа получают при совместном культивировании вирусов, обладающих разными генами гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае происходит быстрое изменение свойств образующегося нового вируса и возникает новый тип вируса. Такой вариант получил еще название «генный шифт» (сдвиг), в отличие от «генного дрейфа» – медленного изменения вирусных свойств из-за точечного мутационного процесса.

Множественная реактивация возникает при заражении клетки несколькими вирусами с дефектными геномами. Если эти повреждения генома различны у разных вирусов, то вирус может репродуцироваться. Это связано с тем, что вирусы с поражением разных генов дополняют друг друга за счет рекомбинации геномов. Результатом этого является продукция жизнеспособного вируса.

Перекрестная реактивация (кросс-реактивация) возникает тогда, когда клетку заражают два вируса, один из которых имеет дефектный геном, а у другого генотип не поврежден. При смешанной инфекции двумя подобными вирусами возникает рекомбинация уцелевших участков генома поврежденного вируса с геномом полноценного вируса; в результате этого появляются вирионы со свойствами обоих родителей.

Гетерозиготность – это формирование вирусов, содержащих в своем составе два разных генома или один полный геном и часть второго. Такой процесс может происходить при совместном культивировании двух штаммов вируса. В свою очередь, у двухцепочечных вирусов (например, у представителей семейства Retroviridae) гетерозиготность представляет собой рядовое явление, такие вирусы могут быть гетерозиготными по большинству маркеров.

Комплементация представляет собой вид фенотипического взаимодействия. Она не меняет генотипы вирусов при совместном их культивировании, однако один из вирусов (или оба) предоставляют друг другу недостающие белки или ферменты для размножения и развития. При этом увеличивается количественный выход как одного, так и обоих вирусов при совместном инфицировании чувствительных клеток. Процесс комплементации может активировать изначально нежизнеспособные вирусы. Примером может быть вирус гепатита В, который обеспечивает жизнеспособность дельта-вируса – дефектного РНК-вируса. Дельта-вирус покрывается белком вируса гепатита В – HВs-антигеном. Возникающая новая инфекция приводит к развитию тяжелых «фульминантных» форм вирусного гепатита.

81

Интерференция вирусов отражает конкуренцию близких или родственных типов вируса за репликативные ферментные системы клетки-хозяина. При этом размножение одного из таких вирусов может подавляться или полностью прекращаться.

Фенотипическое смешивание (или транскапсидация) возникает тогда, когда при совместном культивировании и репликации геном одного из вирусов оказывается заключенным в капсид другого.

5.11. Методы молекулярно-генетического анализа

Исследования генома микроорганизмов потребовали разработки высокочувствительных и точных методов молекулярно-генетического анализа. Основной целью этих методов является идентификация изучаемых генов, определение последовательности их ДНК (секвенирование), а также изучение их функционирования на молекулярном и клеточном уровнях.

Одним из основных способов генетического анализа является метод молекулярной гибридизации. Он обладает высокой чувствительностью, позволяя выявить до 10-10 г специфической нуклеиновой кислоты в 1 мл материала.

Молекулярная гибридизация основана на взаимодействии комплементарных цепей ДНК или РНК и образовании двунитчатых структур. Она может происходить между комплементарными молекулами ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК.

Ее проводят следующим образом:

Осуществляют деспирализацию генетического материала с образованием одноцепочечных структур;

Проводят адсорбцию материала на твердой фазе (обычно на нитроцеллюлозной мембране);

Обрабатывают материал зондом. Зонд – это специфическая искусственно полученная короткая последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарная изучаемой нуклеиновой кислоте и несущая какую-либо метку (обычно радиоактивный фосфор);

Пробы помещают в счетчик радиоактивности и учитывают. Если материал содержал искомую последовательность нуклеиновой кислоты, то это определяется по степени радиоактивности пробы.

Недостатком данного метода является короткий период полураспада изотопа фосфора и необходимость в специальном оборудовании и применении мер защиты. Поэтому наиболее перспективно использование колориметрических реакций, где применяется ферментативная метка.

Одним из наиболее распространенных вариантов молекулярной гибридизации является блотинг по Саузерну (Southern blotting, от англ. blot – пятно, отпечаток). Им выявляют фрагменты ДНК, разделенные электрофорезом в агарозе. Для этого очищенную ДНК нарезают на фрагменты рестриктазами (рестрикционными эндонуклеазами). Далее проводят электрофорез ДНК. После электрофореза фрагменты переносят с агарозы на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры обрабатывают зондом и затем оценивают положение искомого гена на фильтре.

82

Если в качестве материала изучается РНК, то применяют аналогичный способ, который получил название Northern blotting – «северный блотинг». Его используют для обнаружения фрагментов РНК.

Гибридизация in situ используется для выявления ДНК и РНК в клетках. Для нее применяют замороженные срезы ткани, полученной при биопсии, а также другие клеточные структуры.

В начале 80-х годов К.Мюллисом был разработан способ, позволивший значительно увеличить чувствительность метода молекулярной гибридизации. Речь идет о так называемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суть способа заключается в следующем: исследуемый материал, содержащий 2-спиральную нуклеиновую кислоту (ДНК), нагревают до 90-1000С, вызывая тем самым расхождение 2-х-цепочечной ДНК на отдельные цепи. В смесь добавляют набор всех пуриновых и пиримидиновых оснований, праймеры и термостабильную ДНК-полимеразу. Праймерами называются синтетические короткие участки ДНК, комплементарные той нуклеиновой кислоте, которую амплифицируют. Праймеры обычно располагаются с концов (фланкируют) амплифицируемый участок ДНК и служат затравками (инициаторами) полимеризации.

Реакционную смесь охлаждают (обычно до 70-760С). Праймеры присоединяются к разошедшимся цепям. При этом термостабильная полимераза достраивает 2 разошедшиеся цепи ДНК до полных молекул, удваивая тем самым исходное количество генетического материала. Удвоенное количество генетического материала подвергают повторному расхождению и удвоению и так далее. Проведя несколько десятков циклов полимеризации, можно поднять содержание ДНК в исследуемом материале до порога обнаружения. После этого нуклеиновую кислоту выявляют обычной молекулярной гибридизацией.

ПЦР является самым чувствительным из имеющихся в настоящее время методов, позволяя обнаружить всего 100 молекул ДНК или РНК в 1 мл сыворотки. В случае определения молекул РНК (например – вируса ВИЧ) для проведения полимеразной цепной реакции предварительно получают его ДНК-копию с помощью фермента обратной транскриптазы. Затем ход реакции не отличается от вышеописанного.

Другой важной группой генетических методов исследования являются методы определения первичной последовательности нуклеиновых кислот (секвенирование).

Существует несколько методов секвенирования. Одним из них является способ Максама и Гилберта. Сущность его заключается в следующем: из исходного материала выделяют ДНК и переводят ее в одноцепочечную форму. Четыре исходных набора материала обрабатывают различными химическими соединениями, специфически реагирующими только с определенными нуклеотидами в цепи ДНК: пуриновыми (аденином, гуанином) или пиримидиновыми (тимином и цитозином). При этом цепь ДНК разрезается по соответствующему нуклеотиду, который становится концевым. В результате получается 4 набора различных по длине олигонуклеотидов, причем каждый из них заканчивается на соответствующее основание, которое метят радиоактивным фосфором. Затем материал подвергают электрофорезу в агарозе по четырем параллельным трекам. После этого гель накладывают на рентгеновскую пленку и экспо-

83

нируют (проводят радиоавтографию). Сопоставляя все 4 трека, определяют последовательность исходного фрагмента ДНК.

5.12. Генная инженерия

Результаты, полученные при изучении генома бактерий и вирусов с их способностью к мутационной и рекомбинационной изменчивости, послужили основой для развития одной из наиболее перспективных областей биотехнологии – генной инжене-

рии.

Генная инженерия основана на конструировании клеток с новыми генетическими свойствами. Для этого в геном клетки вводят различными способами ген или группу генов, кодирующих требуемый белок (гормон, цитокин и др.) Тем самым в клетке образуется рекомбинантная (или химерная) молекула ДНК. При получении клона клеток, обладающих нужными признаками, его размножают и выделяют необходимый продукт.

Этот процесс осуществляется несколькими путями.

В качестве клеток-продуцентов используют как прокариотические клетки (например – E.coli), так и клетки эукариотов (дрожжи S.cerevisiae, клетки растений или зародышевые клетки млекопитающих).

Для введения нужного участка ДНК в геном клетки-продуцента используют различные векторы. Вектор представляет собой репликон (плазмиду, бактериофаг, ретровирус), который включает необходимый ген и способен к переносу в клеткупродуцент. В этой клетке вектор путем рекомбинации может встраиваться в ее геном и экспрессировать соответствующий белок. Полученный трансформированный клон клеток способен производить необходимый пептид в течение нескольких поколений.

Последовательность ДНК вектора конструируется особым образом. В ней сохраняются гены, ответственные за проникновение, встраивание в геном и репликацию вектора, и удаляются несущественные для этих процессов гены.

Для этого геном вектора разрезается специфическими эндонуклеазами- рестриктазами. Вместо этих генов в геном встраивают последовательности, кодирующие требуемый белок, и соединяют молекулу ДНК в единую цепь ферментом лига-

зой.

Очевидно, что встроенная последовательность ДНК не может быть достаточно большой (обычно – до 10-15 тыс пар нуклеотидов), так как более крупные молекулы просто не могут упаковаться в оболочку вектора (например – в головку бактериофага). Для увеличения необходимой последовательности ДНК в настоящее время конструируют смешанные (химерные) векторы, состоящие из фрагментов нескольких векторов.

К ним относят:

а) космидные векторы (космиды). Они включают небольшой плазмидный вектор (4-5 тыс пар нуклеотидов), участки фага лямбда (cos-последовательности), ответственные за упаковку ДНК в бактериофаг, и достаточно протяженный участок требуемой ДНК, например ДНК человека (до 30-45 тыс пар нуклеотидов);

84

б) фагмиды и фасмиды. Эти два типа векторов схожи, они состоят из фагов и плазмид, однако у фагмид источник репликации вектора – бактериофаг, тогда как у фасмид – плазмида.

В последнее время для генной инженерии эукариотов широко используется ме-

тод микроинъекций ДНК в ядро, а также пересадка клеточных ядер из соматических клеток в яйцеклетки.

Сфера практического применения достижений генной инженерии постоянно расширяется, открывая все новые возможности.

Они могут быть использованы для исправления наследственной и ненаследственной патологии обмена веществ (генотерапия); для создания вакцинных штаммов микроорганизмов; для получения трансформированных штаммов бактерий, способных производить биологически активные соединения (антибиотики, гормоны, цитокины, витамины) в промышленных масштабах.

Одной из наиболее важных задач, стоящих перед генной инженерией, является получение библиотек геномов различных видов организмов, включая человека.

Каждый ген, или группа генов, входящих в такие библиотеки, хранится в отдельном клоне клеток или бактериофаге. Так, например, уже созданы фаговые библиотеки генов, кодирующих активные центры (вариабельные участки) иммуноглобулинов человека. Это делает возможным использование генно-инженерных антител в терапии самых разных заболеваний.

Изучение строения геномов, идентификация и определение функции всех генов человека, животных, микроорганизмов открывает перспективы для предупреждения и лечения наиболее тяжелых болезней, таких, как особо опасные инфекции, сахарный диабет, атеросклероз, онкологическая патология. Этими вопросами занимается новейшая область генетики – геномика.

5.13. Взаимоотношения геномики человека и геномики микроорганизмов

Примерно с середины 90-х годов стало ясно, что методическая база генетических исследований достигла такого совершенства и быстродействия, что стал возможным переход к массовой расшифровке строения геномов разных организмов.

К концу 2000 г. стало известно полное строение геномов многих бактерий (более 40 из них уже опубликовано (см. табл. 2), еще больше пока закрыто из коммерческих соображений), одноклеточных эукариотов (дрожжи), многоклеточных организмов (круглый червь нематода, насекомое плодовая мушка дрозофила, растение арабидопсис).

Таблица 2.

Характеристика некоторых известных геномов микроорганизмов

85

По сравнению с геномами простых организмов расшифровка строения генома человека представляет гораздо более сложную задачу не только из-за размеров генома (например, геном дрожжей имеет 12 миллионов пар нуклеотидов, а человека – 3,2 миллиарда нуклеотидных пар), а главным образом из-за того, что в геноме человека содержится огромное число повторяющихся элементов, неравномерно распределенных по цепям ДНК и имеющих разное строение. Тем не менее, к началу 2001 года эти исследования были завершены.

По их результатам было выявлено следующее:

во-первых, число генов в геноме человека оказалось равным приблизительно 3035 тысячам.

Это значительно меньше, чем предполагалось ранее. Для сравнения в геноме мухи дрозофилы найдено 13600 генов, а у круглого червя нематоды – - около 19000 (см табл. 3).

Таблица 3.

Сравнение размеров геномов и числа генов у различных организмов

86

Те, приблизительно 32-35 тысяч генов, которые на сегодняшний день идентифицированы, составляют только 5% от объема генома, а 95% приходятся на некодирующие последовательности – повторы разных типов, псевдогены, молекулярные остатки вирусов, перемещающиеся геномные элементы и др. Такого явления нет ни у бактерий, ни у дрожжей. Или геном человека не в состоянии избавляться от "генетического балласта", или наооборот, такой генетический материал дает человеку некие преимущества в эволюции. Пока ответ на этот вопрос не получен. Возможно, что преобладание бессмысленных отрезков ДНК служит пассивной защитой от опасных вирусов, поскольку вероятность попадания разрушающей вирусной информации в смысловую область резко уменьшается.

Во-вторых, весьма неожиданным стало обнаружение в геноме человека большого количества генов, которые заимствованы у бактерий. Более трети всех генов человека имеют очевидные признаки сходства с бактериальными генами, особенно генов для повседневных функций. Эти гены обеспечивают клетку энергией, питательными веществами, поддерживают транспорт веществ. Они очень медленно эволюционируют, обеспечивая стабильность клеток в разных ситуациях. По-видимому, длительный эволюционный контакт человека и бактерий привел к тому, что при некоторых случайных заболеваниях гены бактерий попали в геном человека и там закрепились. Такого рода перенос генов «по горизонтали» хорошо известен между разными видами бактерий, но впервые показана широкая возможность такого переноса между геномами человека и бактерий.

В-третьих, внутри генома человека обнаружено большое количество остатков вирусных генов. При интегративных вирусных инфекциях геном вируса встраивается в геном хозяина и может там оставаться практически навсегда. У человека на долю эндогенных вирусов приходится заметная доля всего генома. Это следы вирусных заболеваний, которые поражали человека в ходе эволюции. Большинство вирусных генов не функционирует, однако при некоторых воздействиях на геном они могут включаться и нарушать работу генома. С другой стороны, от этих участков может быть определенная польза как от возможного генетического материала для дальнейшей эволюции. Новые гены чаще всего появляются на основе древних генов. Главные активаторы этого процесса – фрагменты геномов ретровирусов, получившие название мобильных генов. Они могут разрезать ДНК на мелкие фрагменты и заново сшивать фрагменты в новом порядке.

Пока о роли вирусных генов в геноме человека известно крайне мало, однако интересно то, что в геноме обезьян эндогенных вирусов намного меньше или нет вообще. По чужеродным элементам генома человек от обезьян отличается гораздо силь-

87

нее, чем по самим геномам. Отсюда ряд ученых предполагает, что вирусы могли сыграть важную роль в эволюции и становлении человека как биологического вида Homo sapiens.

В целом очевидно, что бактерии и вирусы серьезно влияют не только на конкретный макроорганизм, вызывая инфекционные заболевания, но и на эволюцию человека в целом. Эти взаимоотношения только предстоит выяснить.

Наконец, наиболее важной задачей становится раскрытие путей и методов реализации генотипа в соответствующий ему фенотип. Это является предметом функцио-

нальной геномики, а также протеомики (науки о протеомах). Название последнего но-

вого направления в молекулярной биологии образуется от слова «протеин» (белок) и окончания слова «геном», что подчеркивает теснейшую взаимосвязь белка с кодирующим его геномом.

Протеом представляет собой набор белков данной клетки в данной фазе ее развития в данный момент времени. Протеом – понятие динамическое, тогда как геном относительно стабилен и постоянен. Протеомика занимается изучением вариантов фенотипа клеток для максимальной их адаптации к изменяющимся условиям среды. В таких условиях работа генома формируется в ответ на поступаемые в клетку сигналы. Некоторые из фенотипов клетки связаны с болезнью клеток и организма в целом. В ближайшие годы надлежит понять, как с помощью внешних сигналов и программ добиться блокирования болезни, влияя на реализацию клеточного фенотипа. Знание геномной и протеомной структуры патогенных бактерий является весьма важным для диагностики заболеваний, создания рационально сконструированных вакцин и лекарственных препаратов для их профилактики и лечения.

88

VI. ОСНОВЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

6.1. Экология микроорганизмов

Слово «экология» образовано от греческого oikos – что означает дом или жилище, logos – учение. Экология изучает сложные взаимоотношения микроорганизмов между собой и внешней средой, которые обусловливают их размножение, развитие и выживание.

Под экологической системой понимают совместное функционирование различных биоценозов, т.е. биотического сообщества, включающего все популяции, занимающие данную изучаемую площадь и неживую окружающую природу – биотоп.

Основным положением экологической микробиологии является концепция о доминировании микробов в создании биосферы Земли и последующем поддержании ее экологического баланса. Данная концепция базируется на представлении о микробах как исходно единственных живых обитателях Земли, на повсеместном распространении микробов в биосфере, преобладании биомассы микробов над совокупной биомассой растений и животных, способности микробов участвовать в процессах круговорота веществ, поддерживать радиационный баланс. Такая важная роль микробов обеспечивается многочисленными их популяциями, высокими темпами размножения, способностью переходить на длительное время в состояние покоя, разнообразием в физиологических потребностях, небольшими размерами и массой, определяющими возможность их миграции с воздухом и водой.

Задачи экологии, которые решает медицинская микробиология:

1.Углубленное изучение закономерностей воздействия различных факторов окружающей среды на человека, на его нормальную микрофлору.

2.Разработка методов индикации микробного загрязнения окружающей среды, в том числе в условиях сопутствующего химического, биологического, радиоактивного загрязнения.

3.Определение распространения в окружающей среде микробовпродуцентов биологически активных веществ (и продуктов их жизнедеятельности – токсинов) и оценка их роли в патологии человека.

4.Изучение процессов самоочищения окружающей среды.

5.Дальнейшее совершенствование методов борьбы с внутрибольничной инфекцией.

Биоценоз – микробное сообщество, ассоциация – совокупность популяций разных видов микроорганизмов, обитающих в определенном биотопе (например, в полости рта, в кишечнике, водоеме).

89

Биотоп – место обитания популяции. Для паразитов – это место их локализации в организме хозяина.

Эковар – это вариант какого-либо микроорганизма, приспособленного жить в определенной экосистеме.

6.2. Экологические связи в микробиоценозах

Существующие типы взаимоотношений между микробами в биоценозах разделяются на симбиотические (благоприятные) и анта-

гонистические (конкурентные).

Симбиоз включает следующие основные формы взаимоотношений: нейтрализм – вид отношений, когда обитающие популяции не оказывают друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия; комменсализм – вид сожительства, при котором один из симбионтов живет за счет другого и не причиняет ему вреда. К комменсалам относят представителей нормальной микрофлоры организма человека. Они питаются остатками пищи хозяина, которые в его рационе не имеют значения. Например, аутохтонные бактерии и грибы питаются слущенным эпителием или остатками органических кислот. Мутуализм – взаимовыгодное сожительство – клубеньковые бактерии обладают способностью фиксировать свободный азот воздуха и создают азотистые соединения, необходимые для бобовых растений. Сателлизм – стимуляция размножения микроба другим, сопутствующим видом: сарцины, дрожжи выделяют факторы роста, необходимые для коклюшной палочки. Синергизм – усиление физиологических функций и свойств бактерий при их совместном культивировании. Например, спирохеты, превотеллы, фузобактерии в ротовой полости совместно могут вызывать язвенно-некротический стоматит (ангину Симановского-Плаут-Венсана). Паразитизм – один вид живет за счет другого и наносит ему вред (типичным примером являются паразиты бактерий – бактериофаги).

Антагонистические или конкурентные взаимоотношения лежат в основе инфекции, инвазии, антибиотикотерапии. Антагонизм бывает явный, когда антагонист выделяет антибиотические вещества постоянно, независимо от того, есть конкурент или нет; вынужденный – антибиотические вещества выделяются только в присутствии конкурента; насильственный – когда микробы не являются антагонистами, но при культивировании на голодных средах микроб с большей ферментативной активностью использует другой как продукт своего питания.

Механизмы антагонизма: истощение питательной среды; изменение рН, осмотического давления, дефицит кислорода; образование антибиотических веществ, губительно действующих на микробов-

90