Новиков Д.К. Медицинская микробиология

Психрофильные микроорганизмы – группа микробов, нижняя граница роста которых находится около 0 С. Существуют факультативные и облигатные психрофильные микробы. Факультативные психрофильные микробы могут размножаться при +30 С. К ним относятся иерсинии, псевдомонады, клебсиеллы пневмонии. У облигатных психрофильных микробов верхняя граница роста соответствует 20 С, оптимальная зона 10-15 С. Они обитают в арктических и антарктических водах, ледяных пещерах, почвах вечной мерзлоты. Для психрофильных микробов характерны длительный период генерации, малая плотность популяции и медленно протекающие процессы биосинтеза.

Мезофильные микроорганизмы – группа микробов, температур-

ные границы роста которых находятся в пределах 20-45 С (оптимальная температура 35-37 С). Обитают в организме теплокровных животных, в почве, воде, могут переживать в воздухе.

Термофильные микроорганизмы обитают при оптимальной тем-

пературе роста в диапазоне 45-93 С. Предельные температуры роста простейших находятся в границах 56 С, водорослей - 60 С, грибов - 60-62 С, фотобактерий - 70-72 С, хемолитотрофов – выше 90 С. Облигатные термофильные микробы обитают в фумаролах, кипящих и горячих источниках, промышленных и бытовых водах, самовозгорающихся материалах, конденсатах паровых труб.

Высушивание приводит к обезвоживанию микробной клетки и нарушению окислительно-восстановительных процессов. Наиболее чувствительны к обезвоживанию возбудители сифилиса, менингита, дизентерии, холеры и другие. Однако высушивание почти не действует на спорообразующие бактерии. Так, возбудители ботулизма и возбудители столбняка могут сохранять жизнеспособность в почве несколько лет.

Лиофилизация и высушивание под вакуумом при низкой температуре и последующее хранение в безвоздушной среде обеспечивает жизнеспособность на длительное время и используется для сохранения иммунобиологических препаратов и культур микроорганизмов.

Лучистая энергия. Ультрафиолетовые лучи, инфракрасные, гамма-лучи и солнечный свет воздействуют на микроорганизмы фотонами. Чем выше энергия фотонов, тем сильнее биологический эффект. Так, инфракрасные лучи, соприкасаясь с микроорганизмами, выделяют тепловую энергию, при этом лучистая энергия переходит в тепловую. Рентгеновские и гамма-лучи в больших дозах 280-440 Дж/кг вызывают ионизацию органических веществ, появление свободных радикалов, которые приводят к разрушению ядерного вещества и клеточной ДНК. Малые дозы стимулируют рост микробов. Микроорганизмы более устойчивы к радиоактивному излучению, чем

101

высшие организмы. Их обнаруживают в воде атомных реакторов, залежах урановых руд (тионовые бактерии).

Ультрафиолетовые лучи распространяются в пространстве в виде электромагнитных волн длиной от 10 до 400 нм. Выделяют дальние (110-200 нм) УФ-лучи и ближние – 200-400 нм. В ближних УФ-лучах различают длинноволновую часть спектра (300-400 нм) и коротковолновую – 200-300 нм. Микробицидное действие характерно для коротковолновых УФ-лучей, особенно с длиной 250-270 нм. Механизм их действия связан с поглощением излучения молекулами ДНК, в результате чего образуются тиминовые, тимин-цитозиновые и цитозиновые димеры. Такие повреждения ДНК востанавливаются механизмами темновой репарации и фотореактивации. При действии высоких доз УФ-лучей происходит необратимая цепная реакция окисления липидов и белков. Высокочувствительны к УФ-излучению большинство вегетативных форм бактерий, наименьшей чувствительностью обладают возбудители туберкулеза, стафилококки.

Нескольким меньшим микробицидным действием обладает ультразвук. Практическое применение нашли ультразвуковые волны с частотой колебаний более 20000 Гц для консервации продуктов. Механизм бактерицидного действия ультразвука заключается в том, что в цитоплазме бактерий образуется кавитационная полость, которая заполняется парами жидкости, в пузырьке возникает давление до 10000 атм, что приводит к дезинтеграции цитоплазматических структур.

6.9. Микробиологические основы дезинфекции, асептики, антисептики. Противомикробные мероприятия

К противомикробным мероприятиям, оказывающим прямое повреждающее действие на микробы, относят стерилизацию, дезинфекцию, антисептику и химиотерапию.

Стерилизация – совокупность физических и химических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся (споровых) форм патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Цель стерилизации: предупреждение заноса микроорганизмов в организм человека при медицинских вмешательствах; создание и поддержание асептической и безмикробной (гнотобиотической) среды; исключение микробного обсеменения питательных сред, культур клеток, реагентов при микробиологических исследованиях; предупреждение микробиологической биодеградации (разрушения) лекарственных, диагностических, продовольственных и других материалов.

102

Стерилизации подвергают медицинский инструментарий и аппаратуру, лекарственные и диагностические препараты, перевязочный и шовный материал, белье, предметы ухода за больными, питательные среды, лабораторную посуду.

Процесс стерилизации объектов состоит из следующих этапов: дезинфекция; очистка; сборка, группировка и размещение в стерилизаторе; собственно стерилизация; сушка; контроль за стерилизацией; хранение стерилизованных материалов.

Самый надежный способ стерилизации – автоклавирование. Стерилизующее действие автоклава обусловлено контактом насыщенного пара под давлением с более холодными объектами, что приводит к конденсации пара в воду и сопровождается выделением тепла, повышающего температуру стерилизуемого объекта. Но обезвоживания при этом не происходит.

В зависимости от стерилизуемых материалов температура насыщенного пара устанавливается от 110до 138 С, давление от 0,4 до 2,5 атмосфер, экспозиция от 30 до 60 минут. Простые питательные среды, физиологический раствор, дистиллированную воду, текстильные изделия в свертках стерилизуют при режиме 1 атмосфера (121 С) 15-30 минут. Чувствительные к температуре материалы стерилизуют при более низком давлении (0,4-0,5 атм.).

Сухой жар в 170 С и экспозиции в 60 минут высокоэффективен как стерилизующий агент, но обладает разрушающим действием на объект. Этим способом стерилизуют предметы, плохо проницаемые для пара и не изменяющие свойств под действием высокой температуры (стекло, смазки, гидрофобные вещества). При температуре 180 происходит возгонка жирных кислот и смолистых веществ из ваты и обугливание бумаги, поэтому более 180о температуру повышать нельзя.

Термолабильные материалы (главным образом жидкие) стерилизуют 3-4 кратным (дробным) прогреванием текучим паром при 100 С по 1 часу с перерывом 1 сутки, в течение которых материал находится в термостате (37 С) для прорастания спор.

Дробная стерилизация (тиндализация) при 56-700С по 1 часу в течение 5 дней используется для сред или лекарственных форм с белками, витаминами. При невозможности температурной стерилизации используют фильтрование через антибактериальные фильтры. Для стерилизации воздуха в операционных, боксах и т.д. используют УФ-

лучи.

Крупногабаритные изделия, предметы из термолабильных разнородных материалов стерилизуют в герметических контейнерах парами формальдегида или этиленоксида, а также растворами формалинизопропана при экспозиции 6-24часа (химическая стерилизация).

103

Взаводских условиях медицинские изделия (в основном одноразовые) часто стерилизуют -лучами 0,2-4,5 Мрад (лучевая стерилизация). Необходимо отметить, что микробицидные дозы -излучения очень высоки, что приводит к быстрому разрушению объекта и требует создания сложных систем защиты персонала от радиации. Эффективность стерилизации проверяют бактериологическим посевом.

Кипячение является наиболее простым и легкодоступным методом стерилизации, пригодным для устранения вегетативной формы микробов. Для уничтожения спроносной микрофлоры оно не пригодно.

Стерилизация прокаливанием. Бактериологические петли, сделанные из платиновой или нихромной проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ получил название прокаливания или фламбирования.

Дезинфекция – это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение определенного вида патогенного или условнопатогенного микроорганизма в объектах внешней среды с помощью химических антисептиков, физических, биологических воздействий.

Химические антисептики (дезинфицирующие вещества) применяют в определенной концентрации с таким расчетом, чтобы они действовали на определенный вид микроба за определенное время.

Основная цель дезинфекции – прервать звенья эпидемиологической цепи, то есть оказать воздействие в момент нахождения микроба во внешней среде при его транспортировке от больного к здоровому организму.

Дезинфекция бывает заключительная, текущая, профилактическая.

Заключительная дезинфекция проводится в очагах инфекционных заболеваний. Цель заключительной дезинфекции – обезвредить микроорганизм после госпитализации больного, то есть прервать пути передачи инфекции здоровым людям, уничтожить возбудителя во всех объектах и во всех местах, куда они могли попасть во время пребывания больного на дому.

Текущая дезинфекция проводится, когда больной остается в очаге на какой-то период времени.

Вбольницах ежедневно проводится профилактическая дезинфекция, цель которой – резкое снижение численности популяции всех потенциально патогенных для человека микробов на всех объектах помещения.

Наиболее достоверный контроль за проведенной дезинфекцией – бактериологический. Выпускаются бактериологические тесты (кишечной палочки, стафилококка, антракоида) в специальной упаковке,

104

их помещают в объекты, которые подвергают обработке, а далее из тестов делают посев на стерильность.

Антисептика – совокупность способов подавления роста и размножения условно-патогенных для человека микробов на интактных или поврежденных (раневых) поверхностях кожи, слизистых оболочках и в полостях. С целью антисептики используют химические и биологические антисептики (бактериофаги и препараты из бактерийантагонистов); физические и механические факторы (хирургическая обработка, промывание, дренирование, сорбция).

Антисептики не должны обладать общетоксическим, органотропным, аллергическим, мутагенным, онкогенным, тератогенным и раздражающим действием; антисептики должны обладать высокой противомикробной активностью, т.е. подавлять жизнедеятельность микроорганизмов в малых количествах; хорошо переноситься кожей и слизистыми оболочками; хорошо растворяться в липидах и плохо или умеренно – в воде, что препятствует их всасыванию во внутреннюю среду организма и способствует аккумуляции в коже; они должны локализовать инфект в ране и предупреждать его проникновение в лимфу и кровь; предупреждать адгезию микроорганизма, т.е. прилипание к тканям раневого ложа; подавлять факторы патогенности микробов; усиливать действие антибиотиков и различных физических факторов (например, ультразвука).

Антисептики относят к следующим классам химических веществ:

1.поверхностно-активные вещества (ПАВ) – детергенты (анионного и катионного типа);

2.галогены (препараты хлора, брома, йода);

3.окислители (Н2О2, КМnО4);

4.соли тяжелых металлов (Мg, Hg, Cu);

5.альдегиды (формальдегид);

6.фенол, крезол и их производные;

7.спирты (этиловый спирт);

8.красители (бриллиантовый зеленый, метиленовый синий);

9.производные нитрофурана (фурациллин);

10.производные хинолина (хинозол);

11.фитонциды;

12.антибиотики (грамицидин, неомицин);

13.кислоты (бензойная, салициловая, борная);

14.щелочи;

15.высшие жирные кислоты.

По механизму действия различают: деструктивные антисептики

– вызывают деструкцию белков и липидов ЦПМ (спирты, фенолы, галогены, соли тяжелых металлов); окислители (Н2О2, КМnО4). Так,

105

Н2О2 в тканях быстро распадается под влиянием тканевой каталазы на Н2О и О2, высвобождающиеся свободные радикалы оказывают бактерицидный эффект. В инфицированных тканях этот процесс усилива-

ется. Мембраноатакующие антисептики (ПАВ) изменяют проницаемость клеточных мембран; антиметаболиты и антиферментные

препараты блокируют ферментные системы микроорганизмов (например, 8-оксихинолин инактивирует металлосодержащие ферменты).

Перед применением антисептика выделяют возбудитель и проверяют чувствительность к препарату. Многие микроорганизмы могут выживать и размножаться в антисептиках. Например, P. aeruginosa может размножаться в ПАВ, так как микробы используют эти вещества в качестве источника углерода и энергии.

Асептика – это комплекс противомикробных мероприятий, направленных на предотвращение (предупреждение) попадания на объект, в полость, рану различных микробов, в том числе и патоген-

ных. В комплекс асептических мероприятий входят различные мето-

ды стерилизации, механическая и химическая очистка, дезинфекция, герметизация, изоляция (кювез для новорожденных, бокс). Эти методы применяют при хирургических операциях, приеме родов, парентеральном введении лекарств, приготовлении стерильных лекарственных форм, стерилизации питательных сред.

В микробиологической практике асептика включает: забор материала для исследования стерильным инструментом и в стерильную посуду в условиях, исключающих микробную контаминацию посторонней микрофлорой; предупреждение контаминации материала во время его доставки в лабораторию; использование стерильных петель, пипеток, питательных сред, посуды; предупреждение контаминации микробных культур микрофлорой рук, волос, одежды работника; работу в стерильных боксах, ламинарном потоке стерильного воздуха, в зоне пламени спиртовки.

Несоблюдение указанных мер приводит к неправильному заключению о виде выделенной культуры и ее свойствах, ошибочному диагнозу и неадекватным мерам терапии и профилактики.

6.10. Санитарная микробиология

Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды (включая свободноживущие и паразитические бактерии и вирусы) и влияние микрофлоры на здоровье человека и экологическую ситуацию в различных биотопах. Главная задача практической санитарной микробиологии – раннее обнаружение патогенной микрофлоры во внешней среде.

106

6.10.1. Санитарно-показательные микроорганизмы

Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ) – это представители нормальной микрофлоры, которые выделяются естественным путем в окружающую среду и там сохраняются, поэтому служат показателями санитарного неблагополучия, потенциальной опасности исследуемых объектов. Так, если на объектах обнаруживают нормальных обитателей кишечника, делают заключение о наличии фекального загрязнения и возможном присутствии патогенных энтеробактерий. Так как патогенных представителей меньше и выделить их труднее, то вначале выявляют санитарно-показательные микроорганизмы в окружающей среде, а после их выявления можно проводить поиск патогенных.

СПМ условно разделяют на 3 группы:

1.Группа А включает обитателей кишечника человека и животных, эти микроорганизмы расценивают как индикаторы фекального загрязнения. В нее входят бактерии группы кишечной палочки (БГКП) – эшерихии, энтерококки, протеи, сульфитвосстанавливающие клостридии (С. perfringens), термофилы, бактериофаги, ацинетобактер, аэромонады.

2.Группа В включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки. В нее входят - и -гемолитические стрептококки, стафилококки (плазмокоагулирующие, лецитиназоположительные, гемолитические и антибиотикоустойчивые).

3.Группа С включает сапрофитические микроорганизмы, обитающие во внешней среде, их расценивают как индикаторы процессов самоочищения. В нее входят бактерии-аммонификаторы, бактерии-нитрификаторы, некоторые спорообразующие бактерии, грибы, актиномицеты, целлюлозобактерии, сине-зеленые водоросли.

Санитарно-показательные микробы должны отвечать следующим требованиям: они должны постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и поступать в окружающую среду в больших количествах; не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека и животных; после выделения их в окружающую среду, должны сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микробов, выводимых из организма теми же путями; СПМ не должны размножаться в окружающей среде; не должны изменять свои биологические свойства в окружающей среде; должны быть типичными, чтобы их диагностика, индикация и идентификация осуществлялась без особого труда.

107

Санитарно-показательные бактерии окружающей среды.

1.Вода – бактерии группы кишечной палочки (БГКП), энтерококки, стафилококки.

2.Почва – БГКП, энтерококки, термофилы, возбудители газовой гангрены.

3.Воздух – бета-гемолитические стрептококки, стафилококки. 4.Пищевые продукты – БГКП, энтерококки, стафилококки, протей.

5.Предметы обихода – БГКП, фекальные стрептококки, стафилококки.

6.10.2. Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха, почвы

Вода может быть фактором распространения таких инфекционных заболеваний как холера, брюшной тиф, паратифы, дизентерия, гепатит А, полиомиелит, лептоспироз, сибирская язва, туляремия, туберкулез, Q-лихорадка, грибковые заболевания. В основном вода загрязняется через сточные воды.

Непосредственное определение в воде патогенных микробов очень трудоемко, поэтому сначала определяют наличие СПМ, а затем определяют патогенных возбудителей.

Безопастность воды в эпидемическом отношении определяется ее соответствием нормативам по следующим индикаторным показателям для:

-питьевой воды централизованного водоснабжения – термотолерантным колиформным бактериям общим колиформным бактериям, общему микробному числу, колифагам, спорам сульфитредуцирующих клостридий (Сан Пин 10-124 РБ 99 «Питьевая вода. Гигиенические к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества»);

-воды басейнов – общим колиформным бактериям, колифагам, термотолерантным колифорным бактериям, синегнойной палочке, золотистому стафилококку, отсутствию возбудителей кишечных инфекций (Сан Пин 2.1.2 10-39-2002 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды плавательных бассейнов»);

-требования к качеству воды при нецентрализованном водоснабжении. Санитарная охрана источников (Сан Пин 8-83-98 РБ-98);

-методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды. Методические указания (МУК 4.2. 671-97). Санитарно-показательными микробами для воды считают бакте-

рии группы кишечной палочки – колиформные бактерии. Под этим

108

общим названием объединяют бактерии семейства Enterobacteriaceae,

родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Это грамотри-

цательные, не образующие спор и не обладающие оксидазной активностью палочки, ферментирующие лактозу и маннит до кислоты и газа при 37 С в течение 24 часов. Данные бактерии выделяются во внешнюю среду с испражнениями человека и теплокровных организмов.

Среди колиформных микроорганизмов выделяют группу термотолерантных бактерий, которые ферментируют лактозу при 44 С в течение 24 ч. Эти бактерии являются показателями свежего фекального загрязнения.

Санитарные показатели воды:

1. Общее микробное число – количество мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды, способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37оС в течение 24 часов. Согласно санитарных правил и норм оно не должно превышать 50 колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий в 1 см3 воды.

2.Термотолерантные колиформные бактерии – оценивается число термотолерантных колиформных бактерий в 100 см3 воды, по нормативам в 300 мл исследованной воды они должны отсутствовать.

3.Общие колиформные бактерии – оценивается число общих ко-

лиформных бактерий в 100 см3 воды, по нормативам в 300 мл исследованной воды они также должны отсутствовать.

Это основные показатели, которые определяют при микробиологическом контроле качества питьевой воды. По эпидемиологическим показаниям и при производственном контроле качества питьевой воды оценивают также количество колифагов, которые являются косвенными показателями присутствия в воде энтеровирусов, спор суль-

фитредуцирующих клостридий (С. perfringens), цист лямблий (все они в норме в исследуемой питьевой воде не должны быть обнаружены).

Отбор проб воды для санитарно-бактериологических иссле-

дований. Цель исследований – определение состава и свойств воды по показателям, регламинтированным в нормативных документах, определение источников загрязнения водного объекта, установление программы исследований, принятие соответствующих мер.

Пробы воды для бактериологического исследования отбирают в стерильную посуду, после наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность. Пробу воды отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Объем воды зависит от того, какие микроорганизмы должны быть определены:

109

-при анализе воды на индикаторные микроорганизмы – не менее

500 см3;

-при анализе воды на индикаторные и патогенные микроорганизмы (сальмонеллы, шигеллы) – 300 см3.

Отобранную пробу маркируют, прикрепляют этикетки к емкости,

составляется акт об отборе проб воды с указанием расположением и наименованием места отбора проб, даты отбора, метода отбора, времени отбора, климатических условий окружающей среды при отборе проб, температуре воды, должности и фамилии исполнителя.

В лабораторию пробы питьевой воды доставляют в контейнераххолодильниках при температуре 4-100С. Время начала исследований от момента отбора проб не должно превышать 6 часов, если пробы нельзя охладить, то их анализ проводят в течение 2 часов после забора пробы.

Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре. Из каждой пробы производят посев не менее двух объемов по 1 мл, далее вносят по 1мл воды в стерильные чашки Петри и прибавляют в каждую чашку по 8-12 мл расплавленного и остуженного до 450С питательного агара. Содержимое чашек быстро и равномерно смешивают, избегая образования пузырьков воздуха и попадания агара на края и крышку чашки. Чашки с застывшим агаром инкубируют; учитывают только те из них, на которых выросли не более 300 изолированных колоний. Результат выражают числом KOЕ в 1 мл исследуемой пробы воды.

Термотолерантные и общие колиформные бактерии оценивают методом мембранной фильтрации или титрационным методом.

Метод мембранной фильтрации. Берут объем воды равный 300

мл и фильтруют по 100 мл через разные стерильные нитроцеллюлозные фильтры фильтры (используются микрофильтрационные установки с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и вакуумным насосом для создания разрежения 0,5-1 атм), которые затем накладывают на поверхность дифференциальной диагностической среды Эндо. Подсчитывают количество красных лактозоположительных колоний на среде Эндо, готовят из колоний мазки, окрашивают по Граму в поисках грамотрицательных палочек, определяют оксидазный тест, который должен быть у энтеробактерий отрицательным.

Затем пересевают колонии с грамотрицательными палочками и отрицательным оксидазным тестом на полужидкую среду с лактозой (маннитом, глюкозой) и инкубируют в термостате при 37 С в течение 24 часов для определения количества общих колиформных бактерий. Для определения термотолерантных колиформных бактерий посев производят в среду, подогретую до 44оС, и инкубируют в термостате при 44оС в течение 24 часов.

110