1.1.Установление специфичности в тестах «Испытание на подлинность»

Для установления специфичности в идентификационных тестах, основанных на качественных реакциях, следует убедиться как в отсутствии положительного эффекта реакции на сопутствующие вещества, так и в возможности ингибирования данной реакции компонентами образца.

Провели установление специфичности следующих реакций:

• К 1 мл каждой модельной смеси прибавляли 0,5 мл раствора серебра нитрата (для 5 % раствора);

С модельными смесями 1 и 2 выпадал темно-серый осадок (кислота аскорбиновая), с модельной смесью 3 осадок не образовывался.

• 0,2 мл каждой модельной смеси разбавили 10 мл воды и прибавили по каплям раствор натрия 2, 6-дихлор-фенолиндофенолята;

С модельными смесями 1 и 2 синяя окраска последнего исчезала (кислота аскорбиновая), с модельными смесями окраска сохранялась.

Вывод: Реакции идентификации соответствуют валидационной оценке по показателю «Специфичность»

2. Установление специфичности в тестах «Количественное определение»

Методики, используемые для количественного определения также должны подвергаться валидационной оценке по данному критерию. При этом для всех типов методик существуют свои особенности.

Титриметрические методы. Главным является то, что растворители и сопутствующие компоненты не должны вступать в реакцию с титрантом, кроме того необходимо убедиться в специфичности индикатора. При анализе конкретных объектов следует приготовить модельную смесь и провести её титрование. Поскольку, в ряде случаев, затрачивается часть титранта на взаимодействие с растворителем, проводится контрольный опыт. На основании полученных данных принимается решение о специфичности методики.

Провели установление специфичности иодатометрической методики: к 1 мл каждой модельной смеси прибавили 5 мл воды, 0,15 мл 1% раствора формальдегида, 2 мл 2% раствора кислоты хлороводородной, 0,5 мл 1% раствора калия йодида, 2 мл крахмала и тировали 0,0167 моль/л раствором йодата калия до появления светло-синего окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.

При этом установлено, что на титрование модельной смеси 1 и 2 затрачены равные количества титранта, модельная смесь 3 в данных условиях не титруется.

Провели установление специфичности иодатометрической методики: к 1

К 1,0 мл каждой модельной смеси прибавляют 5 мл воды и титруют 0,05 М раствором йода до слабо-желтого окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.

При этом установлено, что на титрование модельной смеси 1 и 2 затрачены равные количества титранта, модельная смесь 3 в данных условиях не титруется.

3. Валидационная оценка методики анализа кислоты аскорбиновой йодатометрическим методом

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

К 1 мл препарата прибавляют 5 мл воды, 0,15 мл 1% раствора формальдегида, 2 мл 2% раствора кислоты хлороводородной, 0,5 мл 1% раствора калия йодида, 2 мл крахмала и тируют 0,0167 моль/л раствором йодата калия до появления светло-синего окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.

1 мл 0,0167 М раствора калия йодата соответствует 0,008824 г кислоты аскорбиновой.

Расчет теоретического объема титранта проводят по формуле:

(1);

Где V – теоретический объем титранта

а – навеска

K – поправочный коэффициент титранта

в – содержание кислоты аскорбиновой в лекарственной форме

P – 1 мл раствора

Расчет содержания кислоты аскорбиновой в 1 мл раствора проводили по формуле:

(2);

Где V – практический объем титранта

а – навеска

K – поправочный коэффициент титранта

b – содержание кислоты аскорбиновой в лекарственной форме

P – 1 мл лекарственной формы

1. Валидационная оценка методики анализа кислоты аскорбиновой в растворе йодатометрическим методом по показателю «Линейность».

Линейность методики – это наличие прямой пропорциональной зависимости аналитического сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе.

Линейность выражается уравнением у = ax + b. Это уравнение называют линейной регрессией. Параметр b градуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициент a характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики.

Расчет коэффициентов градуировочного графика проводили по формулам и данным таблицы 1:

(3)

(4)

Построение градуировочного графика

Точную навеску кислоты аскорбиновой (5 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в воде, доводил водой до метки и перемешивали (раствор А).

На титрование отмерили последовательно 0,50 мл; 1,0 мл; 1,5 мл; 2,0 мл; 2,5 мл раствора А (0,075 г; 0,010 г; 0,125 г; 0,150 г; 0,175 г.) и проводили определение по методике описанной для количественного определения кислоты аскорбиновой. Данные занесли в таблицу 2.

Таблица 2. Результаты титриметрического определения кислоты аскорбиновой йодатометрическим методом

Объем 5% раствора А (мл)	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5
Содержание кислоты аскорбиновой г/ в навеске	0,025	0,05	0,075	0,1	0,125
Объем 0,167 М йодата калия (мл)	2,5	5,1	8,9	11,0	13,1

Построили градуировочный график зависимости концентраций от объема титранта, рассчитали уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции.

Рисунок 1 - Градуировочный график зависимости объема титранта от концентрации кислоты аскорбиновой.

Основной характеристикой линейности является коэффициент корреляции — мера взаимосвязи измеренных явлений. Коэффициент корреляции (обозначается «r») рассчитывается по специальной формуле:

(5)

При математической обработке рассчитали величину коэффициента корреляции r. Коэффициент корреляции составил: r= 0,992039.

Полученные результаты показали, что существует линейная зависимость между навеской кислоты аскорбиновой и объемом титранта – 0,05 М раствором йода.

Как известно, для аналитических целей можно использовать только ту методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с коэффициентом r, который должен быть ≥0,99.

2. Валидационная оценка методики анализа кислоты аскорбиновой в растворе йодатометрическим методом по показателю «Правильность».

Правильностью аналитической методики называется степень близости экспериментальных результатов к истинному значению во всей области измерений. Главным фактором, определяющим правильность, является значение систематической погрешности.

Согласно рекомендациям ICH необходимо проанализировать не менее 9 образцов на 3 уровнях концентраций. Правильность методики устанавливается в указанном диапазоне ее применения. Для оценки полученных результатов наиболее простым и наглядным критерием служит открываемость (R), которая вычисляется по формуле:

При проведении анализа будут получены 9 значений открываемости.

Для более детальной оценки следует статистически обработать полученные значения R, рассчитав стандартное (SD), относительное стандартное отклонение (RSD) и коэффициент Стьюдента по формуле:

где - истинное значение определяемой величины;

- среднее значение определяемой величины;

m – объем выборки;

SD – стандартное отклонение

Для тестирования методики на правильность готовили три модельные смеси из разных навесок с точным содержанием каждого из компонентов, включая и вспомогательные вещества (таблица 3).

Таблица 3. Приготовление модельных растворов кислоты аскорбиновой

Модельная смесь	1	2	3
Навеска кислоты аскорбиновой (г)	4,0	5,0	6,0
Трилона Б (г)	0,02	0,025	0,03
Натрия гидрокарбоната (г)	1,908	2,385	2,862
Натрия сульфита безводного (г)	0,16	0,200	0,24
Воды для инъекций	До 100 мл	До 100 мл	До 100 мл

Раствор А₁ (модельная смесь 1) Точные навески кислоты аскорбиновой (4,0

г), трилона Б (0,02г), натрия гидрокарбоната (1,908г) и натрия сульфита (0,16 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане и доводят водой до метки.

Раствор А₂ (модельная смесь 2) Точные навески кислоты аскорбиновой (5,0 г), трилона Б (0,025 г), натрия гидрокарбоната (2,385 г) и натрия сульфита (0,200 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане и доводят водой до метки.

Раствор А₃ (модельная смесь 3) Точные навески кислоты аскорбиновой (6,0 г), трилона Б (0,03 г), натрия гидрокарбоната (2,862г) и натрия сульфита (0,24г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде при нагревании на водяной бане и доводят водой до метки.

Проводят 3 параллельных титрования на трех уровнях концентраций (9 определений) по следующей методике количественного определения:

К 1 мл каждой из модельных смесей (А_1, А_2, А₃) прибавляют 5 мл воды, 0,15 мл 1% раствора формальдегида, 2 мл 2% раствора кислоты хлороводородной, 0,5 мл 1% раствора калия йодида, 2 мл крахмала и тируют 0,0167 моль/л раствором йодата калия до появления светло-синего окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.

1 мл 0,0167 М раствора калия йодата соответствует 0,008824 г кислоты аскорбиновой.

Расчет содержания кислоты аскорбиновой (г/мл) проводят по формуле:

где: V– объем титранта, мл;

К– поправочный коэффициент;

Т– титр калия йодата по определяемому веществу, г/мл;

а – навеска модельной смеси, взятая на анализ, мл.

Результаты занесли в таблицу №4 и рассчитали открываемость, стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение и коэффициент Стьюдента.

Таблица 4 – Результаты определения правильности методом йодатометрии

№ п/п	Уровень	Взято модельной смеси, (г или мл)	Взято лекарственного вещества, г	Объем титранта, мл	Найдено лекарственного вещества, г	Открываемость	Метрологи-ческие характерис-тики
1	1	1,0 мл	0,04	4,9	0,0406	101,4	=100,4 SD=1,913 RSD=1,27 t=0.94
2	1	1,0 мл	0,04	5,8	0,0474	102,3
3	1	1,0 мл	0,04	5,0	0,0412	103,5
4	2	1,0 мл	0,05	5,7	0,0498	99,6
5	2	1,0 мл	0,05	5,9	0,0488	97,7
6	2	1,0 мл	0,05	6,1	0,0502	100,4
7	3	1,0 мл	0,06	7,4	0,0607	101,6
8	3	1,0 мл	0,06	7,2	0,0590	98,4
9	3	1,0 мл	0,06	7,2	0,0595	99,1

Т.о.должно находиться в пределах от 98 до 102, следовательно, данная методика соответствует валидационной характеристике «правильность».

Поскольку t =0,94 << (95%, f) =2,31, что позволяет считать результаты выборки результатов свободными от систематической ошибки.