IX. Тонкослойный иммунный анализ с аутосывороткой (тиа)

Чашки Петри ополаскивают этиловым спиртом, высушивают на воздухе и заливают агаром с толщиной слоя 3 мм. В агаре делают 3 лунки диаметром 3 мм. В каждую лунку вносят по 0,025 мл сыворотки кровиисследуемого больного. Чашки Петри выдерживают при температуре 37 С в течение 48 ч. , а затем лунки отмывают водой.

В одну лунку вносят 0,025 мл антигена описторхисов (для обнаруженя Ат в сыворотке больного). В другую лунку вносят 0,025 мл надосадочной жидкости фекалий больного. (Для получения надосадочной жидкости 1 г фекалий больного помещают в центрифужную пробирку, добавляют 9 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают и кипятят над пламенем спиртовки 5 мин.) В третью лунку вносят 0.025 мл изотонического раствора хлорида натрия (контроль).

Чашки закрывают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем агар удаляют, чашки ополаскивают водой и высушивают в токе воздуха. Чашки экспонируют над водяной баней при температуре 56 С в течение 1 мин на расстоянии 8-10 см от поверхности воды. Реакция считается положительной, если в месте контакта сыворотки и с надосадочной жидкостью фекалий, и с описторхозным антигеном образовались крупные капли конденсата, а на других, не сенсибилизированных сывороткой участках, - мелкие капли.

Таким образом, реакция ТИА считается положительной в случае обнаружения и антигенов описторхисов в фекалиях, и противоописторхозных антител в сыворотке крови. Используется в диагностике описторхоза.

Метод цепной полимеразной реакция(ПЦР)- один из наиболее перспективных способов исследования в современной биологии и медицине. Он может быть использован для выявления любых генов, любых фрагментов нуклеиновых кислот. В его основе лежит способ­ность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарны­ми нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кис­лот. После этого двухцепочечную ДНК предварительно денатурируют, а образующиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, кото­рый представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация происходит лишь в том случае, если между зондом и иммобилизованной на мембране нитью ДНК имеется гомология.

Аллергологические методы.

Кожные пробы со специфическими аллергенами. Аллерген вводят внутрикожно или наносят на скарифицированную кожу. У больного сенсибилизированного к данному виду микроорганизма, на месте введения специфического аллергена через 24-48 ч развивается воспалительная реакция (положительный результат). Примером могут служить положительные внутрикожные реакции на тулярин (туляремия), туберкулин (туберкулез), бруцеллин (бруцеллез, проба Бюрне), Малеин (сап), дизентерин (дизентерия, проба Цуверкалова) токсоплазмин (токсоплазмоз).

Пример:

Методы, используемые в диагностике вирусных заболеваний:

1. Вирусоскопический.

2. Иммунной электронной микроскопии.

3. Вирусологический.

4. Серологический.

5. Иммунофлуоресцентный.

6. Биологический.

7. Цепная полимеразная реакция.

.

Серологические методымогут быть использованы для обнаружения в исследуемом материале как специфических антител, так и вирусных антигенов. Для этих целей могут быть использованы все известные серологические реакции:

1. Реакция связывания комплемента.

2. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты (РНАг, РНАт).

3. Реакция торможения гемагглютинации.

4. Реакция гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах).

5. Реакции преципитации в геле.

6. Реакции нейтрализации вирусов.

7. Радиоиммунный метод.

8. Методы иммуноферментного анализа.

Из перечисленных методов всeбольшей популярностью пользуются методы иммуноферментного анализа, отличающиеся высокой специфичностью и удобством использования.