VI. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы

В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнару­жения неизвестного антигена) или антигенов (для обнаружения специфических антител) и специфи­ческих антител, меченных ферментом (нммуноферментный метод — ИФА) или изотопом (радиоимиунный метод — РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность традиционных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое распространение. Эти методы могут быть использованы для диагностики практически любого инфекционного заболева­ния. С их помощью можно определить как антигены любого возбудителя, так и антитела к ним, дифференцируя IgGиIgM.

Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа:

Обнаружение специфических антитгенов с помощью ИФА и РИМ

Первый этап- адсорбцияспецифических антителтвердой фазой, в качестве которой обычно используют поверхности пластиковых панелей. Когда антитела связываются со стенками лунок, у них сохраняются свободными активные центры, поэтому они способны специфически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап- связываниеантигенаизисследуемого материалаза счет реакции антитело + антиген. После этого луночки промыва­ют, дли удаления из системы других, неспецифи­чески связанных с антителами компонентов.

Третий этап— обработкаспецифическими антителамипротив данного антигена, номеченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из систе­мы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антиге­на на поверхности твердой фазы формируется комплекс антитело + антиген + меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Добавление в опытную луночку раствора субстрата приводит к тому, что он подвергается действию пероксидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой может быть определена путем фотометрии.

Радиоиммунный метод(РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэто­му результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов.

Обнаружение специфических антител с помощью ИФА и РИМ

Для обнаружения антител реакции также ставят в три этапа.

Первый этап— адсорбция специфическихантигеновна стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т. е. на их дне а стенках антигены уже адсорбированы.

Второй этап— добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в ней специфических антител к данному антигену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген + антитело.

Третий этап— после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (т. е. антитела против человеческих иммуноглобулинов), но меченные фермен­том (ИФА) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оценивают, как указано выше. В качестве контроля используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Предложены различные варианты иммуноферментного метода. Большое значение имеет вариант ИФМ, позволяющий осуществлять «захват» только антител, относящихся к IgM. Этот метод позволяет более точно производить серологическую диагностику, так как основан на обнаружении специфических иммуноглобулиновIgM, которые появляются при первой встрече с возбудителем.