.4 Методы выделения, анализа, установления структур и биологическая активность полифенольных соединений

1.4.1 Антрахиноны. В составе всех видов щавелей присутствует триада производных антрахинона (хризофанол, эмодин, фисцион), их гликозидированные и восстановленные формы, в некоторых - димерные.

Их многообразие обусловлено наличием в структуре заместителей в α- и β- положениях колец, природой и относительным расположением заместителей, разной степенью окисленности колец. В высших растениях обнаружены также восстановленные формы, отличные от антронов и антранолов – гидроантрахиноны и димерные формы.

Около половины антрахинонов высших растений замещены по одному из бензольных колец; наиболее распространены дигидроксипроизводные: 1,2- 1,3-, 1,4-, 1,6- и 1,8-.

Более сложные природные хиноны имеют димерную структуру с различным типом связи между мономерными фрагментами.

Присоединение углеводных заместителей идет по типу О- или С-связи с преобладанием пиранозной формы β-D-структуры, причем в одной молекуле возможно наличие обоих типов связи.

Характерным свойством окисленных форм является их устойчивость на воздухе, а также к колебаниям температур и рН-среды. Гидроксиантрахиноны – желтые, оранжевые, красные вещества - дают ярко окрашенные растворы в щелочах и в концентрированной серной кислоте.

В зависимости от количества и расположения ОН-групп, гидроксиантрахиноны дают различное окрашивание с ацетатом магния в спиртовом растворе: 1,2- дигидроксиантрахиноны окрашиваются в фиолетовый, 1,4-дигидрокси – в пурпурный, а 1,3-,1,6- и 1,8-дигидрокси – в оранжево-красные цвета.

Димерные формы антрахинонов в растворах щелочей окрашены в желтые и зеленые цвета, переходящие по мере окисления в красно-коричневый. Подкисляя щелочной раствор и экстрагируя эфиром, можно отделить фракцию, которая при добавлении пиридина окрашивается в красный цвет, а в концентрированной серной кислоте – в зеленый цвет. Такое окрашивание дают соединения с диантроновой структурой, димеры с 1,1^’- типом связи и свободными 2- и 4-ОН –группами [186].

Гликозиды хорошо растворимы в воде и спиртах и почти нерастворимы в других органических растворителях, в которых растворимы агликоны. Поэтому гликозиды извлекают водой, спиртами или водно-спиртовой смесью, чаще всего применяется экстракция этанолом и метанолом. Для получения агликонов гликозиды подвергают ферментативному или кислотному гидролизу, а затем извлекают антрахиноны эфиром, бензолом или хлороформом [195;196].

Химические методы полезны и при разделении антрахинонов, содержащих окси-, метокси- и карбоксигруппы.

Так, при обработке экстрактов водным раствором гидрокарбоната натрия в водный слой переходят вещества, содержащие в молекуле карбоксильную группу; водным раствором карбоната натрия извлекают вещества с β – оксигруппами и метоксигруппами в бензольном кольце, а вещества с α – оксигруппами переходят только в водный раствор едкого натра, что обусловлено внутримолекулярной водородной связью с карбонильной группой. Такую дробную экстракцию можно использовать при разделении сложных смесей веществ [197].

Чаще всего полученные после экстракции и удаления растворителя фракции антрахинонов разделяют адсорбционной или тонкослойной хроматографией. Для разделения свободных агликонов применяют колоночную и препаративную тонкослойную хроматографию на полиамиде и силикагеле различных марок [198].

Для разделения и идентификации антрахинонов также используют гель-фильтрацию на сефадексах, молселлектах и разделение на различных целлюлозах и ионообменниках, электрофорез на бумаге с использованием в качестве электролита 0,05 и 0,1 н растворов бората натрия в 0,1 н растворе гидроксида натрия [186].

Для разделения различных типов антрагликозидов пригодны методы противоточной экстракции, жидкость-жидкостной (ЖЖХ), капельной противоточной, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или сочетание хроматографических и других методов [186].

Для идентификации и доказательства индивидуальности природных производных антрахинона широко применяется хроматография на бумаге с использованием двух типов растворителей: смесей спиртов с кислотами и водой для анализа и разделения гликозидов и малополярные растворители – для анализа агликонов. Хроматограммы просматривают в УФ-свете; при этом агликоны светятся желтым или оранжевым, антроны, антронолы и диантроны – желто-зеленым, гликозиды – розовым или оранжевым цветом, димеры – от соломенно-желтого до светло-коричневого.

В зависимости от степени окисленности колец в соединении, количества, природы и взаимного расположения заместителей, подвижность антрахиноновых производных на бумаге и в тонком слое сорбента различна: чем больше заместителей в структуре, тем меньше величина R_f. Гидроксигруппы в β – положениях снижают величину R_f в малополярных растворителях. Метилирование и ацетилирование α – гидроксигрупп приводит к снижению R_f, аналогичные производные β – гидроксиантрахинонов имеют более высокие значения R_f [186;199].

В качестве систем для хроматографического анализа на бумаге используют: бензол-метанол (9:1); толуол-н-бутанол-уксусная кислота (1:1:1); н-бутанол-метиловый спирт-вода (5:5:1) или (5:2:2); бензол-ацетон (8:2); н-бутанол-уксусная кислота-вода (40:12,5:29) [199].

Применение тонкослойной и адсорбционной хроматографии на силикагеле дает большие возможности для разделения сложных смесей оксиметилантрахинонов. Для тонкослойной хроматографии используют пластинки Silufol UV₂₅₄ в системах растворителей: этилацетат-метанол-вода (100:17:13), бензол-метанол (9:1), толуол-этилформиат-муравьиная кислота (5:4:1).

Разделение антрахинонов возможно и с помощью хроматографии на колонках силикагеля марки КСК. Промывают колонки смесями растворителей: толуол, этиловый эфир муравьиной кислоты и муравьиная кислота (5:1), смесь бензола и четыреххлористого углерода (1:1), этилового спирта и бензола (92:8).

В качестве сорбентов используются также карбонаты кальция, цинка, магния, сульфаты магния и кальция, оксиды алюминия, магния, кальция, целлюлоза, полиамид [200].

Димерные структуры хорошо разделяются на диоксиде кремния, пропитанном 0,01 н или 0,5 н щавелевой кислотой, в системе бензол-ацетон (9:1), на сефадексе LH-20, на целлюлозе, причем более четкое разделение зон наблюдается при «мокром» способе заполнения колонок.

Смесь окисленных и восстановленных форм удается разделить на бумаге, пропитанной 11% раствором соевого масла, с использованием в качестве растворителя смеси метилцеллюлоза-вода (4:1).

Таким образом, для разделения и идентификации производных антрахинона применимы практически все виды хроматографии. Их можно использовать также для препаративных целей, количественного анализа и для очистки от сопутствующих веществ [186].

Идентификацию производных антрахинона часто проводят методами хроматографии при сопоставлении с веществами-свидетелями и с литературными данными при условии аналогичного процесса хроматографирования. Однако более достоверны спектральные методы и наиболее полную информацию о структуре соединений дают методы электронной спектроскопии с диагностическими добавками, ИК, ПМР, ¹³С-ЯМР и масс-спектрометрии, которые используются раздельно и в комплексе.

Характер электронного спектра производных антрахинона, особенно положение и интенсивность длинноволновой полосы поглощения, существенно зависит от количества, положения и электронных эффектов заместителей.

Электронный спектр поглощения антрахинона имеет вид трех широких полос. По максимуму поглощения щелочных растворов в УФ-области можно отличить антрахиноны от бензо- и нафтохинонов [195; 201-203].

Установлены изменения в УФ-спектрах при переходе от антрахинонов к антронам и диантронам. Первый максимум для антронов и диантронов сдвигается в более коротковолновую область, меньше 220-230 нм и практически не замеряется. Второй максимум между 250-270 нм сдвигается при переходе от антрахинона к антрону по направлению к более длинным волнам от 0 до 9 нм; при переходе от антрона к диантрону – от 3 до 15 нм, а от антрахинона к диантрону – от 13 до 21 нм. Третий максимум для диантронов не найден [186].

Спектры поглощения в ИК области позволяют идентифицировать функциональные группы, внутри- и межмолекулярные водородные связи, не прибегая к качественным реакциям и микроанализу. Гидроксигруппы в β- и α – положениях различаются областью поглощения, причем количество полос в каждой из этих областей соответствует количеству ОН-групп.

Для ИК-спектров антрахинонов выявлены некоторые закономерности, которые могут быть полезными при отнесении неизвестных антрахинонов по частотам и интенсивностям поглощения к одной из определенных групп: β –гидроксигруппы могут быть определены по появлению полосы в области 3600-3150 см^-1, что характерно для ОН-групп, способных образовывать межмолекулярные водородные связи. Производные антрахинона без α-гидроксигрупп, имеют одну сильную карбонильную полосу в области 1678-1653 см^-1; вещества с одной α – гидроксигруппой имеют две полосы карбонильных групп, одну – в области 1678-1653 см^-1, другую более сильную – между 1637 см^-1 и 1621 см^-1, причем разница их частот находится в пределах 24-38 см^-1; замещение двумя α-гидроксигруппами в 1,4- и 1,5-положениях дает спектры с единственной карбонильной полосой между 1645 см^-1 и1608 см^-1; соединения с двумя α-гидроксигруппами в 1,8- положениях имеют две полосы, одну между 1678 см^-1 и 1661 см^-1 и другую более сильную – между 1622 см^-1 и 1616 см^-1, разница между пиками составляет 40-57 см^-1; замещение α-гидроксигруппами в 1,4,5-положениях дает единственную карбонильную полосу между 1616 см^-1 и 1592 см^-1; соединения с четырьмя α-гидроксигруппами, например в 1,4,5 и 8-положениях имеют единственную карбонильную полосу между 1592 см^-1 и 1572 см^-1; полоса С=С связей в 1,4 и 1,5-диоксиантрахинонах имеет частоту выше 1575 см^-1, в то время, как для 1,4,5-триоксиантрахинонов меньше, чем 1575 см^-1.

Сравнение ИК-спектров антрахинонов, антронов и диантронов показывает, что в спектрах антронов и диантронов отсутствует полоса карбонильной группы около 1660 см^-1.

В спектрах некоторых антронов иногда видны два максимума поглощения в указанном интервале. Разница между спектрами антронов и диантронов состоит в том, что в последних отсутствует максимум при1390 см^-1. Размер углеводного цикла, тип связи с агликоном и между углеводными фрагментами определяют по характеру поглощения в области 800-980 и 1010- 1100 см^-1[186; 195].

Метод ПМР спектроскопии позволяет получить максимально достоверную информацию о степени и характере замещения.

В связи с тем, что многие антрахиноны имеют фенольные гидроксигруппы, константы заместителей фенолов можно использовать при изучении химических сдвигов ароматических протонов, а также положения заместителей. Сигналы α-протонов лежат в области 8,32-8,23 м.д. в случае отсутствия заместителей в кольце, а при наличии заместителей – от 7,99-6,72 м.д. Сигналы β-протонов при отсутствии заместителей лежат в области от 7,33 до 6,13 м.д. Константа взаимодействия протонов в м-положении составляет 2,4-2,6 Гц.

Хелатные α-гидроксигруппы резонируют в очень низком поле. Ацетильные группы в β-положении, как правило, дают сигналы от 2,24 до 2,52 м.д., а в α-положении – в области от 2,24 до 1,93 м.д. Сигналы алифатических протонов находятся в области 2,87-1,4 м.д. Сигналы метильных групп, присоединенных к ароматическому кольцу, лежат в области 2,10-2,63 м.д., находящиеся в конце алифатической цепочки – в области 1,13-0,92 м.д. Сигналы метоксигрупп наблюдаются около 3,6 м.д.

При изучении строения природных антрахинонов часто возникает проблема определения положения О-метильных и О-гликозидных заместителей, особенно для соединений, обладающих 1,8-дигидроксигруппировкой, если одна из этих групп этерифицирована или гликозидирована. Гликозидирование какой-либо одной из гидроксигрупп 1,8-дигидроксиантрахиноновой системы сдвигает сигналы орто-положения в область более высокого поля на 0,3-0,5 м. д. и пара-положения протона на 0,1-0,2 м.д. в то время, как сигналы остальных протонов остаются неизменными [204].

Метод ¹³С – ЯМР, в комплексе с другими, используют для доказательства строения углеродного скелета, при этом характеристичными являются сигналы резонанса углеродных атомов карбонильных групп, по изменению положения которых судят о характере α- и β- замещения (в отсутствии α-замещения сигнал прописывается около 178-182 м.д., при наличии экранирования – 186-192 м.д.).

Сигналы других углеродных атомов в растворах CDCL₃ и ДМСО прописываются следующим образом: С_1,4,5,8 – 132-136 м.д., С_2,3,6,7 в интервале 121-128 м.д., узловые С – около 113-114 м.д. [186; 205].

Для определения количественного состава сложных смесей, молекулярной массы, функционального и изотопного состава используют метод масс-спектрометрии. В соответствии со структурой антрахиноновых молекул и характером замещения в них, в масс-спектрах проявляются характерные особенности фрагментации, такие как наличие сигнала молекулярного иона (М⁺), сигналов фрагментов (М⁺ -ОН, М⁺ - СО, М⁺ - НСО, М^{+ -}-2СО, М⁺ - СН₃, М⁺ - СН₂ОН и др.) [186; 206;207].

Биологическая активность антрахинонов и их производных. Химиотерапевтические и фармакологические испытания и обширный опыт

народной медицины показали, что индивидуальные природные антрахиноны обладают разносторонней физиологической активностью, причем наибольшая активность выявлена у гликозидированных, димерных и восстановленных форм. Окисленные формы антрахинона проявляют, в зависимости от дозы, вяжущий или слабительный эффект, умеренное противоопухолевое, противовоспалительное и радиозащитное действие.

Выявлено, что хризофанол обладает рострегулирующей активностью в отношении пищевых растений, его оксимы, гидразоны, фенилгидразоны и нитропроизводные проявляют фунгицидную и бактерицидную активность. Производные антрахинона угнетают рост стрептококков и стафилококков, причем наибольшую активность проявляют реин, эмодин и алоэ-эмодин.

Эмодин и реин угнетают рост меланомы на 76%, эмодин тормозит рост рака молочной железы, а реин – развитие асцитного рака Эрлиха.

Природные димеры с различным типом связи обладают не только слабительным действием, но и проявляют микоцидную активность.

Хризофанол, эмодин, фисцион и многие их производные обладают высокой антиокислительной активностью.

Антрахиноны типа алоэ-эмодина, алоина, хризофанола и другие входят в состав косметических препаратов по уходу за кожей и волосами [162; 170-171; 173, 186].

Антрахиноны, антроны, антронолы проявляют как слабительный, так и антипсориатический эффект. Так, препарат Дитранол, содержащий 1,8-дигидроксиантранол, затрудняет кислородное питание и клеточное деление в псориатической эпидерме, ингибирует энзимы, что указывает на его митохондриальное воздействие. Слабительный эффект характерен для амино- и гидроксиантрахинонов, гидроксиантронов и антронов, но антипсориатическую активность проявляют только антроны [186].

1.4.2 Флавоноиды относятся к одной из самых распространенных групп природных соединений. Большинство из них находятся в растениях в виде гликозидов, многообразие которых обусловлено не только положением и большим набором сахаров, но и различием в величине окисных циклов, а также конфигурацией гликозидных связей [208].

Процесс извлечения флавоноидов можно сочетать с гидролизом гликозидных форм хлороводородной или серной кислотами при нагревании. Метод избирательной экстракции заключается в извлечении флавоноидов из растительного сырья различными растворителями в определенной последовательности. С помощью низкокипящего петролейного эфира и четыреххлористого углерода вначале добиваются обезжиривания сырья, удаления воскообразных и смолистых веществ. Затем, для выделения флавоноидов проводят экстракцию растительного сырья спиртами, ацетоном и их разнопроцентными водными растворами. Полученное извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду и удаляют неполярные соединения (хлорофилл, жирные масла, эфирные масла) хлороформом или четыреххлористым углеродом. Флавоноиды из водной фазы извлекают последовательно эфиром (агликоны), этилацетатом (монозиды) и бутанолом (биозиды, триозиды и т.д.) [200].

Для разделения флавоноидов используют адсорбционную хроматографию на силикагеле, полиамиде, LH-20 или целлюлозе. Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с метиловым спиртом с возрастающей концентрацией метилового спирта, водно-спиртовыми смесями, с возрастающей концентрацией спирта, если сорбентом служит полиамид, или 5-30% уксусной кислотой в случае целлюлозы [200].

Для выбора более селективного метода извлечения флавоноидов целесообразен хроматографический анализ компонентов или группового состава веществ в анализируемом объекте.

О- и С-гликозиды изофлавонов и флаванонов делят на колонках или пластинках силикагеля и кремневой кислоты в системах БУВ (40:12,5:29 и 4:1:5).

При двумерном хроматографировании в качестве второй подвижной фазы используют 2,6 или 15% уксусную кислоту.

Силикагель используется для разделения изофлавонов, флаванонов, дигидрофлавонолов, метилированных и ацилированных флавонов и флавонолов с использованием в качестве элюентов хлороформа, его смеси с эфиром и (или) этилацетатом, бензолом 1:1, бензол-этилацетат 6:1. Метилированные флавоны элюируют смесью бензол-гексан 3:1 и хлороформ-метанол 50:0,8 или 99,5:0,5, бензол-хлороформ 5:2, бензол-эфир 5:1. Используя в качестве элюентов этилацетат и его смесь с метанолом 9:1, бензол с метанолом 9:1 на силикагеле можно разделить флаваноны, флавонолы и флавоны.

Магнезол используют для разделения смеси флавонов, флавонолов, флаванонов и их гликозидов. Изофлавоны можно отделить, используя в качестве элюента смеси бензол-хлороформ 1:1 и хлороформ, а смесью ацетон-эфир 1:1 можно разделить флаваноны, флавонолы.

Оксид алюминия можно использовать для разделения флавоноидов различной кислотности и полярности. Например, используя бензол и эфир, можно отделить хлорофиллы и ксантофиллы, а затем бифлавоноиды, 5-окси-, 5-дезоксифлавоноиды, 3^’4^’– 6,7- и 7,8-диоксифлаваноны и дигидрофлавонолы.

Целлюлоза может быть использована для всех групп флавоноидов и их гликозидов. На колонках целлюлозы делят флавоноиды и их метокси- и (или) ацетоксипроизводные.

Полиамид различных марок широко используется для разделения и очистки всех групп флавоноидов.

На полиамиде успешно делят моно-, ди- и тригликозиды, антоцианидины с различным числом гидроксильных групп и их расположением.

Гликозиды изофлавонов, флаванонов, дигидрофлавонолов, флавонов и флавонолов разделяют элюентами: бензол-метанол 3:1, 7:3, 6:4, 1:1.

Гликозиды флавонов и флавонолов можно делить с использованием водно-метанольных смесей, а смесь моно-, ди- и триметоксипроизводных кемпферола и кверцетина разделяют с использованием элюента: хлороформ-метанол-метилэтилкетон-2,4-пентадион 20:10:5:1 или хлороформ-этилацетат 3:1, хлороформ – метанол 1:3.

Флаваноны делятся в системе бензол-уксусная кислота – вода 125:72:3, хлороформ-уксусная кислота –вода 2:1:1 бензол – пиридин –муравьиная кислота 6:9:5, дигидрофлавонолы – хлороформ-метанол-уксусная кислота 7:1:1.

Флавоноиды с тремя и более гидроксильными группами рекомендуется хроматографировать на полиамиде, гликозидированные формы флавоноидов – на микрокристаллической целлюлозе, метиловые эфиры флавоноидов лучше разделяются на полиамиде.

Одним из основных методов сравнительного исследования и препаративного выделения флавоноидов различной природы является метод ВЭЖХ [200].

Тонкослойная хроматография используется для обнаружения и идентификации флаванов и их ацетильных производных. В первом случае используются пластинки силикагеля и силона с полярными системами растворителей, во втором – пластинки силуфола и неполярные системы растворителей: бензол-ацетон (8:2), так как ацетильные производные проантоцианидинов – неполярные вещества [209].

При наличии в структуре простых эфирных связей щелочной гидролиз проводят в мягких условиях.

О-гликозидная связь легко гидролизуется под действием разбавленных минеральных и органических кислот с образованием сахара и агликона. Обычно для этой цели используют 2-5% водный или водно-спиртовый раствор соляной или серной кислоты, гидролиз проводят при 100^оС.

Для гидролиза С-гликозидной связи требуются более жесткие условия (смесь концентрированных соляной и уксусной кислот). Продолжительность гидролиза во времени различна и зависит от строения, в частности от размера окисного цикла, конфигурации аномерного центра, строения сахара [210].

α – гликозидные связи гидролизуются быстрее β – гликозидных.

Щелочной гидролиз используют для установления порядка связи в биозидах и отличия 1→2 порядка связи от 1→3, 1→6. 1→3 связь расщепляется быстрее, 1→4 и 1→6 значительно медленнее, а 1→2 связь не подвергается гидролизу [211].

Для установления тонкой структуры флавоноидных молекул, наряду с химическими методами, используют УФ-, ИК-, ПМР, ¹³С – ЯМР – спектроскопию и масс-спектрометрию.

УФ-спектроскопия применяется для идентификации и исследования строения флавоноидных молекул с применением таких реактивов, как хлорид алюминия, этилат натрия, безводный ацетат натрия, борная кислота с ацетатом натрия и др.

Флавоны и флавонолы обнаруживают сильную полосу поглощения при 320-380 нм (полоса I) и при 240-270 нм (полоса II).

Спектры замещенных флавонов и флавонолов в нейтральных и щелочных растворах показывают, что полоса I связана с циннамоильной группировкой, а полоса II – с поглощением бензоильного фрагмента.

Соединения, которые содержат только заместители в положении 4^’ (апигенин, кемпферол), обнаруживают одиночный, хорошо выраженный максимум; если в 3’ и 4’ (лютеолин, кверцетин) – два максимума или один максимум и «плечо».

Если в кольце В находятся три заместителя (мирицетин), полоса II имеет только один максимум.

При наличии свободной гидроксигруппы в положении 5 или 3 образуется комплекс с хлористым алюминием, что вызывает батохромный сдвиг I и II полос. 3,5 - оксифлавоны образуют комплексы, устойчивые к разбавленной соляной кислоте, в этом случае наблюдается батохромный сдвиг порядка 60 нм. Спектры 7-оксифлавонов в ацетате натрия изменяются (по сравнению с раствором в спирте), полоса 250-270 нм претерпевает батохромный сдвиг на 8-19 нм. Флавоны, имеющие в положении 7 метокси- или гликозидированную группу, подобного сдвига не обнаруживают.

Неустойчивость флавонолов в растворе этилата натрия можно использовать для определения присутствия группировки 3,4^’ – гидроксигрупп.

О- диоксигруппировку можно обнаружить по сдвигу длинноволновой полосы в присутствии борной кислоты и ацетата натрия, которые повышают кислотность гидроксигрупп благодаря образованию комплекса.

Во флаванолах кольцо В не сопряжено с карбонильной группой, поэтому они обнаруживают наиболее сильное поглощение в области 270-290 нм (полоса II), тогда как полоса I образует максимум невысокой интенсивности при 320-330 нм. Соединения с 5-ОН группой с хлористым алюминием дают батохромный сдвиг около 25 нм, применение ацетата натрия вызывает батохромный сдвиг (10 нм) максимума для 7-оксифлаванонов [210].

Спектры поглощения лейкоантоцианидинов (флавандиолов-3,4) и катехинов (флаванолов – 3), подобны спектрам полиоксифенолов, у которых отсутствует сопряжение с карбонильной группой. Максимум поглощения находится при 280 нм и в щелочных растворах претерпевает сдвиг на 10-20 нм [212].

Максимумы поглощения С-гликозидов флавоноидов близки к максимумам поглощения их агликонов.

Отмечено, что в присутствии плавленого ацетата натрия для С-гликозидов лютеолина со свободной гидроксигруппой у седьмого атома углерода наблюдается батохромный сдвиг 21-25 нм, для С-гликозидов апигенина 8-11 нм.

У С-гликозидов изофлавонов один из максимумов более ярко выражен, как и у соответствующих агликонов [213].

При анализе ИК-спектров флавоноидных молекул обнаружено, что они определяются наличием ароматической системы колец А и В, связью С-О-С среднего кольца, С=О группой, которая может быть сопряжена с кольцом В (флавоны, флавонолы) или нет (флаваны), наличием других функциональных групп и связей заместителей.

Например, С=О группа флавоноидов прописывается в области 1620-1690 см^-1, ее положение и интенсивность, в значительной степени, зависят от возможности или невозможности образования водородной связи с соседними заместителями, а также тем, сопряжена ли она с р-электронами кольца В или нет. Так, незамещенный флавон имеет полосу С=О группы в области 1650 см^-1, введение гидроксигруппы в 3 положение, приводит к раздвоению полосы С=О, что связано с увеличением ароматичности гетерокольца С. Для 3,5-диоксигруппировки характерно положение полосы С=О связи в области 1640-1660 см^-1. Введение гидроксигрупп в положения 7,3^’,4^’- смещает полосу колебания С=О группы в сторону низких частот.

В ИК-спектрах ацилированных флавоноидов кроме С=О группы кольца С, прописывается еще С=О группа сложноэфирной связи кислотного остатка в области 1690-1785 см^-1. Например, флавоноиды, ацилированные остатками галловой, кофейной, феруловой кислот обнаруживают полосу С=О группы кислоты в области 1700-1715 см^-1, а в ацетатах флавоноидов – при 1750 см^-1.

Для флавоноидов с незамещенным кольцом В характерно наличие колебаний С-Н связей в области 730-745 и 684-702 см^-1. При наличии в положении 4^’ заместителя выделяются полосы при 831-837 см^-1 и 790-810 см^-1.

3^’,4^’ – замещение характерно в спектре наличием трех или более полос в области 680-860 см^-1. ОН –группы, отличающиеся по степени поляризации, прописываются различно с небольшим смещением полос. Так, 3-ОН группа обнаруживается в области 3350-3250 см^-1, 7-ОН группа дает интенсивную полосу при 3200-3700 см^-1, а 4^’ –ОН – в области 3450-3350 см^-1 [212, 214].

На основании ИК-спектров можно установить пиранозную и фуранозную формы углеводного заместителя, а также конфигурацию гликозидных связей в пиранозидах.

Для пиранозидов, характерно наличие трех интенсивных полос поглощения в области 1100-1010 см^-1, принадлежащих колебаниям кольца и валентным колебаниям С-О. Полосы при 1000±10 см^-1 (сильной и средней интенсивности) принадлежат валентным колебаниям С-О в группировке –О-С-О- гликозидного звена. В случае дезоксисахаров (α-рамнозиды) имеется полоса при 970 см^-1, которая принадлежит конечной СН₃ –группе. Полоса при 917±13 см^-1 относится к ассиметрическим колебаниям пиранозного кольца. Полоса при 890 см^-1 является надежным признаком β-конфигурации гликозидной связи. α- конфигурация гликозидной связи может быть определена по полосе при 840±10 см^-1, с одновременным отсутствием полосы 890 см^-1. Экваториальные С₂-Н и С₄-Н-группы в рамнозидах и галактозидах дают полосу слабой интенсивности при 876±9 см^-1. К симметричным колебаниям относят одну из полос при 805 или 770 см^-1.

При исследовании фуранозидов обнаружено, что они, в отличие от пиранозидов, имеют только две полосы поглощения в области 1100-1010 см^-1 [212; 215; 216].

В ¹Н-ЯМР-спектрах флавоноидов четко различаются химические сдвиги всех протонов колец А, В и С и протоносодержащих заместителей [210].

Чаще всего в растениях встречаются флавоноиды с флороглюциновым типом связи кольца А (5,7-диокси-), поэтому протоны Н-6 и Н-8 во флавоноидах резонируют в виде двух дублетов в области 6,0-6,5 м.д. с характерной для мета-взаимодействия J=2.5Гц, причем сигнал протона Н-8 прописывается в более слабом поле, по сравнению с сигналом Н-6.

Если к С-7 присоединен остаток углевода, то сигналы Н-6 и Н-8 сдвигаются в слабое поле [217; 218].

Некоторые из природных флавоноидов окислены только по 7-положению, тогда Н-5 экранирован С=О – группой и прописывается около 8,0 м.д. в виде дублет-дублетного сигнала. В ПМР-спектрах ацилированных ароматическими кислотами флавоноидов в области 6,0-8,0 м.д., дополнительно к протонам флавоноидного агликона, прописываются сигналы протонов кислоты [218].

Протоны кольца В, обычно, прописываются в области 6,7-8,2 м.д. В случае 4^’- замещения, Н-2^’ и Н-6^’ резонируют в виде двухпротонного дублета в области 7,1-8,1 м.д., а Н-5^’ и Н-3^’ также дают двухпротонный дублетный сигнал в области 6,5-7,1 м.д. с характерной для орто-взаимодействия константой расщепления в 8,5 Гц. Сигналы Н-2^’ и Н-6^’ флаван-3-олов прописываются в области 6,4-6,9 м.д., сигналы Н-5^’ и Н-3^’ - в области 5,9-6,5 м.д., у флаванонов сигналы Н-2^’ и Н-6^’ - в области 7,1-7,3 м.д., у флавонолов – 7,9-81 м.д., у флавонов – 7,7-7,9 м.д., при этом сигналы Н-5^’ и Н-3^’ для всех вышеперечисленных соединений прописываются в области 6,5-7,1 м.д. В случае 3^’,4^’ –диоксизамещения Н-5^’ проявляется в виде дублета около 6,7-7,1 м.д., а при Н-6^’ – в виде квадруплета. У флавоноидов с 3^’,4^’,5^’ –степенью окисленности сигналы Н-2^’ и Н-6^’ прописываются как двухпротонный синглет в области 6,5-7,5 м.д. Метилированные или гликозидированные по 3^’ и 5^’ –ОН-группам флавоноиды имеют не эквивалентные Н-2^’ и Н-6^’ и вместо двухпротонного синглета прописываются как дублет с J=2Гц [219; 220].

Сигналы протонов Н-5 и Н-3 кольца С у флаван-3-олов прописываются в виде синглетов в области 4,9-5,5 м.д., сигналы метоксигрупп - в области 3,5-4,1 м.д. [218].

Химический сдвиг первого протона углеводного фрагмента, непосредственно присоединенного к флавоноидной молекуле, зависит от природы флавоноида, положения и стереохимии присоединенного углеводного остатка. В природных О-гликозидах чаще всего отмечается β-форма связи и в случае 3-глюкозидов аномерный протон (Н-1^’’ ) прописывается в виде дублета при 5,7 м.д.; в случае присоединения глюкозы в положение 7 – сигнал аномерного протона сдвигается в сильное поле и дает мультиплет за счет свободного вращения 7-О-гликозидного остатка около флавоноидного ядра, но если в положениях 6 или 8 имеются заместители, то свободное вращение сдерживается и Н-1^’’ прописывается как дублет около 5 м.д. Рамнозиды чаще встречаются в виде α-L-формы. В случае присоединения рамнозы в положение 3, Н-1^’’ дает сигнал при 5,05 м.д., в положении 7 – около 5,25 м.д. Место присоединения рамнозы сказывается на химическом сдвиге протонов группы СН₃; так у 3-рамнозидов обнаруживается дублет в области 0,8-0,9 м.д., тогда как в 7-рамнозидах этот сигнал смещается в область 1,1-1,2 м.д. [219; 220].

Масс-спектрометрия флавоноидов хорошо дополняет информацию, полученную с помощью других физико-химических методов. По данным масс-спектра можно сделать вывод о том, как соединены функциональные группы друг с другом в молекуле, о размере и структуре боковых цепей [210].

Основным путем фрагментации флавоноидов является ретродиеновое расщепление центрального кольца с переносом и без переноса атомов водорода к кольцу А.

Образующийся при этом м-диоксибензилкатион из кольца А (m/e 152) является основным пиком (в случае 5,7-диокси-замещения кольца А), затем последний последовательно теряет карбонильные группы и переходит во фрагмент с m/e 124 и 96.

Из кольца В на первой стадии образуются катионы оксифенилацетиленов, соответствующей степени замещения (m/e 118 - для 4^’-замещения, m/e 134 - для 3^’, 4^’-замещения и 150- для 3^’, 4^’,5^’). Последние ионы, отщепляя на первой стадии формильный радикал, дают ионы с m/e 90, 106 и 122 [221].