ПІДГОТОВКА ПРАКТИЧНИХ ПИТАНЬ ДО ПМК-1

1. ПРОВОДИТИ МІКРОСКОПІЮ ПРЕПАРАТУ З ВИКОРИСТАННЯМ ІМЕРСІЙНОГО ОБЄКТИВУ, ЗРОБИТИ ВИСОВОК ПРО МОРФОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ДОСЛІДЖУВАНИХ МІКРООРГАНІЗМІВ

Спочатку можна пояснити, що для мікроскопії потрібно зробити препарат-мазок - (препарат-мазок готують на предметному склі із матеріалу або чистих культур мікроорганізмів і досліджують у мікроскопі з метою виявлення збудників захворювань чи дослідження їх морфологічних і тинкторіальних(Г- чи Г+) властивостей. Препарат-мазок із бактерій ще називають бактеріальним препаратом).

Для фарбування використовують анілінові барвники - це похідні аніліну, які використовують для фарбування мікроорганізмів з метою збільшення їх контрастності та подальшої мікроскопії. При мікроскопії використовується імерсійна система складається з імерсійного об'єктиву (х 90) та імерсійного.масла, яке забезпечує концентрацію променів, що проходять через мікроскопічний об'єкт в об'єктив і, таким чином, забезпечує кращі умови для дослідження мікроорганізмів.

Методика виготовлення бактеріального препарату-мазку

1. Приготування суспензії бакгерій(берете бактеріологічну петлю, прокалюєте в пальнику, на предметне скло наносите бактеріальною петлею наносите краплинку фізрозчину, потім вносите бактеріальною петлею культуру бактеріальних клітин з пробірки чи чашки Петрі і розтираєте по кругу)

2. Висушування суспензії бактерій (над вогнем) та одержання мазку.

3. Фіксація мазку (проводимо предметним склом через вогонь 3 рази). Мета фіксації: вбити мікроби, закріпиш їх на сьслі і забезпечити краще їх фарбування.

4. Фарбування мазку(фарбують бактерії різними методами, але в основному методом Грама див. методику в №2)

5. 11ромивання(диетильованою водою змиваємо залишки барвника)

6. Висушування препарату-мазку(легенько промокаємо фільтрувальним папером і даємо підсохнути остаточно на повітрі).

На готовий препарат наносимо краплину імерсійного масла і ставимо на предметний столик мікроскопу, спочатку шукаємо поле зору під звичайним об'єктивом, а потім під імерсійним, що дає збільшення в 90 раз, опускаємо об'єктив до моменту, коли він доторкнеться до краплинки імерсійного масла!Регулюємо мікрогвинтом! Висновок: якщо в полі зору круглі бактерії, то за морфологією - коки чи кокоподібні, якщо палички - бацили чи паличкоподібні, якщо спіралеподібні, то звивисті. Якщо забарвлення фіолетове чи синє — грампозитивиі, якщо червоне чи рожеве — грамнегашвні.

2. ПРИГОТУВАТИ БАКТЕРІАЛЬНИЙ ПРЕПАРАТ, ЗАФАРБУВАТИ ЗА МЕТОДОМ ГРАМА, ЗДІЙСНИТИ МІКРОСКОПІЮ З ВИКОРИСТАННЯМ ІМЕРСІЙНОГО ОБ'ЄКТИВУ, ЗРОБИТИ ВИСНОВОК ПРО ЧИСТОТУ ДОСЛІДЖУВАНОЇ КУЛЬТУРИ МІКРООРГАНІЗМІВ. ОПИСА ТИ КУЛЬ ТУРАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ КОЛОНІЙ МІКРООРГАНІЗМІВ, ЯКІ ВИРОСЛИ НА ПОВЩРХШМЛА. ОБГРУНТУВАТИ НАСТУПНИЙ ХІД ДОСЛІДЖЕНЬ Використовуємо матріал з білету № 1!

В даному завданні вимагають методику за Грамом - це складний метод фарбування, що дозволяє диференціювати одні мікроорганізми від інших, а також вивчити особливості будови мікробних клітин. Метод розробив Крістіан Грам у 1884р.Серед складних методів фарбування він є найбільш універсальним. Він має важливу, диференпійно-діагностичне значення, оскільки допомагає визначити таксономічне положення тих чи інших бактерій.

Тинкторіальні властивості бактерій - здатність та індивідуальна особливість бактерій забарвлюватись тими чи іншими барвниками називають їх тинкторіальними властивостями.

Грампозитивні бактерії забарвлюються за методом Грама в темно-фіолетовий колір (здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом).

Грамнегативні бактерії забарвлюються за методом Грама в червоний колір (сполука з генціанвіолетом та йодом вимивається спиртом, тому вони забарвлюються фуксином в червоний колір).

Можна пояснити чому бактерії по різному фарбуються за методом Грама! Сучасні теорії, що пояснюють механізми фарбування за грамом

1. Відмінність в кислотності білків цитоплазми у грампозитивних та грамнегативних бактерій.

Ізоелектрична точка білків цитоплазми грампозитивних бактерій знаходиться в межах рН 2-5, у грамнегативних бактерій - в межах рН 5-7. Кислі білки грампозитивних бактерій мають спорідненість до анілінових барвників, утворюють з йодом стійкі до дії спирту комплекси.

2. Особливості нуклеїнового складу бактерій.

У грампозитивних бактерій виявлено велику кількість рибонуклеїнату магнію (співвідношення РНКгДНК у грампозитивних бактерій дорівнює 8:1, а у грамнегативних бактерій 1:1). Вважають, що рибонуклеїиат магнію утворює великі стійкі комплекси з барвником і йодом, які не вимиває спирт.

3. Особливості хімічного складу та будови клітинної стінки.

Клітинна стінка грампозитивних бактерій містить до 90% глікопептиду (муреїн), містить тейхоєві кислоти. Муреїн багатошаровий.

У грампозитивних бактерій, можливо, проникність клітинної стінки нижча, ніж у грамнегативних бактерій. Комплекс генціанвіолет-йод утримується в стінці після дії спирту, оскільки при цьому зменшується діаметр пор в глікопептиді. Стінка грамнегативних бактерій містить глікопептиду значно менше, його молекула "зшита" слабкіше порівняно з стінками грампозитивних бактерій. Вважають, що після обробки етиловим спиртом пори в молекулі глікопептиду грамнегативних бактерій залишаються широкими, що дозволяє екстрагувати комплекс генціанвіолет-йод. Методика фарбування за методом Грама:

1. На фіксований жаром мазок кладуть трохи коротшу і вужчу від предметного скла смужку фільтрувального паперу. Зверху на неї наносять достатню кількість розчину генціанвіолету (основний барвник) на 1-2 хв, зливають його і знімають папірець.

2. Після прополіскування мазка водою наносять розчин Люголя на 1 -2 хв.

3. Зливають розчин Люголя і, не промиваючи мазок, знебарвлюють його етанолом протягом ЗО — 60с.

4. Препарат ретельно промивають водою, висушують, наносять краплю кедрової олії, мікроскопують з імерсійни об'єктивом.

Висновок: Чиста культура - це популяція мікроорганізмів одного виду, яка вирощена на стерильному црарівному середовищі.

Чистоту досліджуваної культури ми визначаємо при розгляді під мікроскопом. Якщо культура чиста, то спостерігатимемо бактерії одної морфології(або палички або коки), | одного забарвлення — Г- - червоні, рожеві; Г+ - фіолетові, сині. За призначенням і складом МЛА відноситься до основних поживних. середовищ.

Основні поживні середовища - це середовища, які за укладом, наявністю живильних речовин придатні для культивування багатьох видів бактерій.

МЛА - до м'ясо - лептонного бульйону додають дрібно нарізаний агар-агар. Одержану суміш кип»ятять до розчинення агар-агару, фільтрують встановлюють рН і розливають у флакони.

Колонія - потомство однієї мікробної клітини, що виросло на поверхні, або в глибині твердого поживного середовища.

S-колонія - гладкі, круглі, опуклі, мають рівний край та гладку і блискучу поверхню. При пересіві на рідке поживне середовище утворюють рівномірне помутніння. R-колонія - для них характерною є неправильна форма, зазубрений край і зморшкувата, шорстка поверхня. При пересіві на рідке поживне середовище утворюють зернистий осад. S-R-дисоціація - одна з форм внутрішньо популяційної мінливості, коли в популяції з'являються особи та клони, які відрізняються від висхідного типу формою колоній та іншими ознаками (наприклад, втратою капсули, рухливості; зниження ферментативної активності, вірулентності, антигенності; чутливості до фагів, фізичним та хімічним факторам та ін.)

Ознаки колоній

1. Розмір: великі (діаметр більш як 4-5 мм), середні (2-4 м), дрібні (1-2 мм). Якщо діаметр становить менш 1 мм. то такі колонії називають точковими.

2. Форма: кругла, розетко подібна, зірчаста, листковидна, тощо.

3. Колір: білий, жовтий, червоний; безбарвні. Відзначають, чи виділяється пігмент у середовище.

4. Профіль: плоский, плоско-припіднятий, злегка опуклий, горбистий, опукло- порізаний, з удавленим центром, з опуклим центром, куполоподібний.

5. Контур края: рівний, зазублений, зубчастий, хвилястий, фестончатий, війчастий, бахромчастий, нитчастий, гіллястий.

б.ІІрозорість: прозорі, напівпрозорі, непрозорі.

7. Поверхня: гладка, шорстка, зморшкувата, горбиста; блискуча, матова.

8. Структура: однорідна, дрібнозерниста, грубозерниста, волокниста.

9. Консистенція: суха, волога, слизиста.

Висновок: Характеристика колоній - важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії. Визначення виду збудників за їх культуральними властивостями називається культуральною ідентифікацією. На МЛА ростуть аеробні бактерії. І охарактеризовуєте повністю колонії, які побачите за критеріями, що вказані вище!

3. ОПИСАТИ ВЛАСТИВОСТІ КОЛОНІЙ МІКРООРГАНІЗМЕ, ЯКІ ВИРОСЛИ НА СЕРЕДОВИЩІ ЕНДО. ЗНАЙТИ КОЛОНІЇ ХАРАКТЕРНІ ДЛЯ Е. COLI.

ПОЯСНИТИ СУТЬ ВИКОРИСТАННЯ ДИФЕРЕНЦІАЛЬНО - ДІАГНОСТИЧНИХ СЕРЕДОВИЩ З ВУГЛЕВОДАМИ.

Диференціальио-діагностичні середовища - це середовища, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх диференціацію. Вони поділяються па середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, редукуючих властивостей бактерій.

Середовище Ендо використовується для виявлння ферментації вуглеводів.Це середовище дозволяє виявити розкладання лактози бактеріями. Воно дозволяє проводити первину диференціацію бактерій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого виділення чистих культур з їх наступною ідентифікацією. Склад середовища Ендо: Сухий живильний агар Субстрат - 1 % лактоза

Індикатор - основний фуксин (знебарвлений розчином сульфіту натрія)

Висновок: свіже середовище Ендо має світло рожеве забарвленя. Робите характеристику колоній, які виросли на середовщі за ознаками, що вказані в білеті №3 і уточнюєте:при рості лактозо позитивних бактерій, що розщеплюють лактозу(в нашому випадку E.colf), їх колонії забарвлюються у малиново-червоний колір з металевим блиском., колонії мають дископодібну форму, злегка опуклі з рівними краями. Колонії лактозо негативних мікробів (сальмонели, пшгели) на цьому середовищі

безбарвні.Мікроорганізми здаші ферментувати певні вуглеводи, завдяки використання таких середовищ ми можемо ідентифікувати той чи інший мікроорганізм.

4. ОБГРУНТУВАТИ СУТЬ ВЛКЦИНОПРОФШАКТИКИ. ПІДІБРАТИ 2-3 ЖИВІ ВАКЦИНИ, ПОЯСНИТИ ПРИНЦИПИ ЇХ ВИГОТОВЛЕННЯ І ВИКОРИСТАННЯ інфекційні хвороби можна попередити шляхом активної або пасивної імунізації. Активна імунізація проводиться з допомогою вакцинних препаратів. Імунопрофілактика - профілактика інфекційних захворювань шляхом створення імунітету до них за допомогою імунологічних методів - активної і пасивної імунізації. Імунотерапія - лікування хворих шляхом впливу на систему імунітету.

Вакцини - вміщує життєздатні штами патогенного мікроорганізму з максимально зниженою вірулентністю, але збереженими антигенними властивостями, яка створює напружений імунітет, схожий з постінфекційним.

Вакцинація основана на здатності організму до набутого імунітету і створення імунологічної памяті в відношенні збудника.

Вакцина жива - вміщує житгєздатні штами патогенного мікроорганізму з максимально зниженою вірулентністю, але збереженими антигенними властивостями, яка створює напружений імунітет, схожий з постінфекційним.

Для виготовлення живих вакцин використовували методи зниження вірулентаості(атенуацію) бактерій, вірусів, створюючі несприятливі умови культивуваня. При виготовленні деяких вакцин збудники культивують у курячому ембріоні(рикетсії висипного тифу, віруси ірипу, кору, паротиту), вирощують вакцинні штами у культурах тканин(вакцини проти кору, жовтої гарячки, поліомієліту, сказу).

Крім атенуації, живі вакцини. можна одержувати шляхом селекції (відбору) з існуючих у природі штамів таких варіантів, які мають найменшу вірулентність(вакцшш проти бруцельозу, туляремії, віспи, поліомієліту). Недоліки живих вакцин:

1. Важко збрігаються,

2. Важко стандартизувати,

3. Важко контролюється активність,

4. У людей з імунодефіцитами живі вакцини можуть викликати захворювання.

У даний час змінився принцип атенуації. З цією метою використовують генетично - модифіковані мікроорганізми(бактерії, віруси). Такі вакцини містять або непатогенні мікроорганізми, які синтезують антигенні детермінанти певного патогенного збудника або штами патогенних бактерій, у яких вилучені гени патогенності. Наприклад - штам холерного вібріону, у якого влучено ген, що кодує А1 пептид, що відповідає за синтез ентеротоксину.

Інший спосіб отримання атенуйованих вакцин — вилучення з геному патогенних бактерій ділянок гнів, які відповідають за незалежні життєво важливі функції(протисальмонельозна вакцина). Живі вакцини більш ефективні, ніж інактивовані.

Живі

Бактеріальні - БЦЖ, Від сибірки (СТИ), Бруцельозна, Туляремійна, Чумна (ЕУ) Вірусні

Антирабічні: (МШД Фермі), Віспна, Проти кору, Поліомієліт на (Себіна), Проти жовтої гарячки,

Паротит на, Аденовірусна, Проти вітряної віспи, Проти краснухи

Рикетсіозні;

Проти гарячки КУ (М-44), Комбінована висипнотифозна вакцина.

5. ОБГРУНТУВАТИ СУТЬ ВЛКЦИНОПРОФШАКТИКИ. ПІДІБРАТИ 2-3 ВБИТІ ВАКЦИНИ; ПОЯСНИТИ ПРИНЦИПИ ЇХ ВИГОТОВЛЕННЯ І ВИКОРИСТАННЯ

Інфекційні хвороби можна попередити шляхом активної або пасивної імунізації. Активна імунізація проводиться з допомогою вакцинних препаратів. Імунопрофілактика - профілактика інфекційних захворювань шляхом створення імунітету до них за допомогою імунологічних методів - активної і пасивної імунізації. Імунотерапія - лікування хворих шляхом впливу на систему імунітету.

Вакцини - вміщує життєздатні штами патогенного мікроорганізму з максимально зниженою вірулентністю, але збереженими антигенними властивостями, яка створює напружений імунітет, схожий з постінфекційним.

Виготовлення вбитих вакцин складний і відповідальний процес. Він розпочинається з підбору вакцинного штаму, який повинен мати виражені вірулентні та імуногенні властивості. Культуру засівають на оптимальні поживні середовища для одержання значної кількості біомаси бактерій. Після цього готують маточні суспензії, які піддають інактивації. Залежно від її способу розрізняють гріті вакцини (культуру прогрівають при 56- 60 С протягом 1-2 год); формо лові вакцини, спиртові, ацетонові (при дії на мікроби відповідних хімічних речовин). На наступному етапі вакцини стандартизують тобто встановлюють певну густоту їх суспензії. Препарати піддають обов'язковій перевірці на стерильність, антигенність, імуногенність, реактогенність. Після цього одержані-вакцини розливають в ампули й закупорюють. Бактеріальні

Черевнотифозна, Холерна, Кашлюкова, Бруцельозна (лікувальна), Гонококова

(лікувальна), Стафілококова (лікувальна)

Вірусні

Грипозна

Поліомієліт на (Солка) Проти кліщового енцефаліту Антирабічна Спірохетозні Лептоспірозна

6. ПОЯСНИТИ СУТЬ АНТИТОКСИЧНОГО ІМУНІТЕТУ. ПІДІБРА ТИ ПРЕ ПАРА ТИ ДЛЯ СТВОРЕННЯ АКТИВНОГО АНТИТОКСИЧНОГО ІМУНІТЕТУ

Інфекційні хвороби можна попередити шляхом активної або пасивної імунізації. Активна імунізація проводиться з допомогою вакцинних препаратів. Імунопрофілактика - профілактика інфекційних захворювань шляхом створення імунітету до них за допомогою імунологічних методів - активної і пасивної імунізації. Імунотерапія - лікування хворих шляхом впливу на систему імунітету. Вакцини - вміщує життєздатні штами патогенного мікроорганізму з максимально зниженою вірулентністю, але збереженими антигенними властивостями, яка створює напружений імунітет, схожий з постінфекційним.

В залежності від механізму утворення набутий імунітет поділяють на природний і штучний,а кожний з них в свою чергу на активний і пасивний. Природний активний імунітет виникає внаслідок перенесення захворювання в тій чи іншій формі, прості чи ускладненій. Штучний активний імунітет — утворюється в результаті привичок вакцинами.

Імунітет антитоксичний - несприйнятливість організму до інфекційних захворювань, збудники яких продукують екзотоксини. Імунітет антитоксичний досягається активною імунізацією, введенням в організм анатоксину, що викликає синтез антитоксинів, антитоксичних сироваток чи пасивною імунізацією.

Антитоксичний імунітет направлений на нейтралізацію мікробних ядів. В найбільш чистому вигляді антитоксичний імунітет проявляється при токсичних інфекціях (дифтерія, правець, ботулізм, газова гангрена). В механізмі антитоксичного імунітету мають значення не лише наявний титр антитоксинів, але й здатність організму до їх вироблення.

8. Підібрати препарати, які використовують для специфічної профілактики і терапії дифтерії, пояснити аспекти їх

ВИКОРИСТАННЯ

Дифтрія - гостре інфекційне захворювання, що викликається токсигенними коринебактеріями дифтерії, передається повітряно-краллиним шляхом; характеризується місцевим фібринозним запаленням переважно слизових оболонок рото- і носоглотки, а також явищами загальної інтоксикації, ураженням серцево-судинної, нервової і видільної системи.

Токсигенність пов'язана з продукцією екзотоксину. Перелік профілактичних і лікувальних засобів.

АД —м-анатоксин (анатоксин дифтерійний очищений, адсорбований зі зменшеним вмістом антигену, рідкий)

АДП-анатоксин (анатоксин дифтерійно-правцевий очищений,адсорбований рідкий)

АДП-м-анатоксин (анатоксин дифтерійно-правцевий очищений, адсорбований із

зменшеним вмістом антигенів, рідкий)

АКДП-адсорбована кашлюково-дифтерійно-правцева вакцина.

Д.Т. Кок (адсорбована вакцина для профілактики дифтерії, кашлюку та правця).

Тетракок (комбінована вакцина для профілактики дифтерії кашлюку, правця і

поліомієліту).

Сироватка протидифтерійна, коняча, очищена, концентрована, рідка.

9. Пояснити суть імуноферментного методу досліджень.

ЗДІЙСНИТИ ОБЛІК ІФА, ПОСТАВЛЕНОГО З МЕТОЮ СЕРОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ВІЛ-ІНФЕКЦІЇ

Імуноферментний аналіз (ІФА) заснований на використанні як мітки антитіл ферментів, здатних розкладати субстрати з утворенням забарвлених продуктів. Використовуються як прямий, так і непрямий варіанти ІФА. Суть її полягає в тому, що спочатку на якомусь твердому матеріалі сорбують антигени (або антитіла), а потім додають всі інші інгредієнти серологічної реакції. Як твердофазнї носії антигену чи антитіл широко використовуються пластикові планшети, шарики, плівки, пробірки з різних синтетичних матеріалів. Адсорбовані на поверхні таких матеріалів антигени чи антитіла навіть у висушеному стані довгий час зберігають свою імунологічну специфічність і здатність вступати в серологічні реакції.

Наявність і активність ферменту,--зв'язаного з антитілом чи комплексом антиген- антитіло виявляють і оцінюють візуально за інтенсивністю забарвлення після інкубації з відповідним субстратом. ІФА може бути виконаний за допомогою спеціального обладнання, в якому автоматично відбувається промивка реагентів буфером (вошер) та результат реєструється за допомогою фотометра (рідер).

Сировата крові осіб з підозрою на ВІЛ-носійство обстежується за допомогою ІФА. Це відбувається в спеціалізованих лабораторіях. Основним матеріалом для дослідження є кров. Її збирають із ліктьової вени об'ємом 5 мл. ІФА(в основному непрямий метод) дозволяє визначити антитіла у будь-якому дослідженому матеріалі. Він є достатньо чутливим методом. Антигени для цих тест-систем одржують або із заражних тканинних культур або за допомогою рекомбінантних ДНК. В Україні використовують тест-систми «Антиген», «Рекомбінант-ВШ», «Скрин-ВІЛ», «Комбі-ВІЛ», фірми «АЬЬоиЬ.

Антитіла у крові з'являються н зразу після попадання ВІЛ в організм, а н менш ніж через 2-3 місяці, а деколи й довше(5-8 міс.). Реакцію рекомендують повторити тричі. Діагностичними вважаються 2 позитивних результати з 3. Зразки крові, які дали 2

позитивних результати направляють у спеціалізовані лабораторії при науково-дослідних інститутах для підтвердження ВІЛ-вірусоносійства за допомогою твердо фазного імуноферментного аналізу - вестернблоту або імуноблоту, реакції" непрямої імунофлуоресценції або радіо імунної преципітації. Ці мтоди дозволяють виявити антитіла до певних вірусних білків.