MolBiol_sivolob

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Одну з можливостей замінити нуклеотид за допомогою ПЛР ілюструє рис. 11.10. Як матриця для ампліфікації використовується плазміда, котра містить послідовність-мішень. Реакція проводиться у двох варіантах – із різними наборами праймерів. Один із двох праймерів у кожному наборі містить замінений нуклеотид, як показано на рисунку. Результатом ампліфікації є лінійні молекули ДНК із заміненою нуклеотидною парою. Об'єднання продуктів ампліфікації, денатурація і потім ренатурація приводять до того, що половина молекул обмінюється ланцюгами: оскільки дволанцюговий розрив має різне положення у продуктах ампліфікації, утворюються дві циркулярні молекули з одноланцюговими розривами. Після трансформації в бактеріальну клітину лінійні молекули (друга половина матеріалу) руйнуються бактеріальними нуклеазами, а одноланцюгові розриви в циркулярних молекулах репаруються. У результаті відбувається клонування послі- довності-мішені, яка містить замінену нуклеотидну пару.

Денатурація – ренатурація

Рис. 11.10. Спрямований мутагенез за допомогою ПЛР. Послідовність-мішень зафарбована блакитним кольором

Велика кількість білків (у тому числі, ферменти, що використовуються в рекомбінантних технологіях) виробляються шляхом експресії в бактеріальних клітинах. Поряд із прокаріотичними розроб-

346

Розділ 11. Методи молекулярної біології

ляються й використовуються також системи експресії рекомбінантних білків в еукаріотичних клітинах. Особливо важливими еукаріотичні системи експресії є для еукаріотичних білків, котрі не можуть бути синтезовані бактеріальною клітиною в активній формі. Це, зокрема, стосується білків, які піддаються суттєвим посттрансляційним модифікаціям – наприклад, глікопротеїдів.

Методи аналізу структури й експресії генів і геномів

Блот-гібридизація

Саузерн-блотинг. Потужним засобом аналізу складних сумішей ДНК щодо наявності там специфічних елементів послідовності є блотгібридизація на нітроцелюлозних фільтрах за Саузерном (Edward Southern). Назва процедури, яку схематично зображено на рис. 11.11, походить від слова blotting (промакування): фрагменти ДНК розділюються за допомогою гель-електрофорезу (залишаючись невидимими в гелі), після чого на гель накладають нітроцелюлозний фільтр, а під та над цим “сендвічем” розміщують фільтрувальний папір і занурюють нижній шар паперу в лужний розчин. Під дією капілярних сил розчин піднімається до верхнього шару паперу, “захоплюючи” при цьому ДНК і переносячи її з гелю на нітроцелюлозу. Одночасно при цьому ДНК денатурується лугом. У результаті одноланцюгова ДНК опиняється на фільтрі – середовищі, придатному для подальшої гібридизації, а сам фільтр є точною реплікою вихідного гелю. Так само можна перенести ДНК на нітроцелюлозу, застосувавши електрофорез у поперечному напрямку – із гелю на фільтр. Далі проводять обробку фільтра зондом – одноланцюговим фрагментом ДНК певної послідовності, який містить радіоактивну мітку. Зонд гібридизується з комплементарною ДНК у певних досі невидимих смугах, що можна зафіксувати за допомогою авторадіографії.

У такий спосіб можна встановити, наприклад, наявність у геномі додаткових копій послідовності, що є гомологічними вже відомій; присутність у невивченому геномі генів, гомологічних відомим генам; присутність специфічних послідовностей ДНК у препаратах, що отримані з білково-нуклеїнових комплексів. Прикладом одного з численних застосувань Саузерн-блотингу є метод фингерпринтингу ДНК (DNA fingerprinting). Метод базується на факті наявності в еукаріотичних геномах мінісателітних повторів (див. розділ 4) – невеликих елементів

347

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

послідовності, що тандемно повторюються в різних місцях геному кілька разів. Розподіл локусів за кількістю повторів є індивідуальним – так само, як відбитки пальців. З метою ідентифікації особини (чи особи – у криміналістиці, судових справах тощо) геномну ДНК обробляють рестриктазою, що не має своїх сайтів усередині повтору. Фрагменти розділяються шляхом електрофорезу, здійснюється блотинг і гібридизація з радіоактивно міченим елементом послідовності мінісателіта. У результаті на авторадіограмі представлено специфічний для особини набір фрагментів різної довжини, тобто різної кількості повторів мінісателіта – своєрідний молекулярний відбиток (DNA fingerprint).

Рис. 11.11. Блот-гібридизація

Нозерн-блотинг відрізняється від описаної процедури блотингу за Саузерном лише тим, що на гель для електрофорезу наносять сумарний препарат виділеної мРНК. Гібридизація з міченим фрагментом ДНК (наприклад, кДНК із бібліотеки клонів) дозволяє встановити наявність певної мРНК, тобто активність гена, у клітинах певного типу, після дії активуючих / репресуючих факторів тощо, а також оцінити рівень цієї активності (концентрацію мРНК) за інтенсивністю забарвлення смуги на авторадіограмі. Назва методу (nothern) є просто жартівливою аналогією з буквальним значенням прізвища Саузерна.

348

Розділ 11. Методи молекулярної біології

Вестерн-блотинг – назва, що продовжує цю аналогію – це метод перенесення білків з гелю після електрофорезу на фільтр з метою аналізу складних білкових сумішей. Фільтр обробляють антитілами, специфічними до певного білка, потім міченими (наприклад, флуоресцентною міткою) антитілами до цих антитіл. Практично, це єдиний спосіб детектувати наявність малої кількості конкретного білка в тотальному білковому препараті.

Визначення стартових і кінцевих точок та рівня активності транскрипції

Кілька описаних нижче прикладів ілюструють деякі підходи, розроблені для характеристики транскриптів і дослідження рівня транскрипційної активності.

Картування за допомогою нуклеази S1 дозволяє не тільки визна-

чати старт і кінцеву точку транскрипції певного гена, а й оцінювати рівень транскрипційної активності цього гена. Процес починається з клонованого фрагмента гена, який містить кінцеву точку, яка має бути встановленою. Навкруг неї обирають два рестриктні сайти однієї рестриктази, і ще один – іншої, як показано на рис. 11.12. Перша рестриктаза вирізає фрагмент, залишаючи одноланцюгові вирости на 5'-кінцях. Використовуючи їх як матрицю, фрагмент Кленова ДНК-полімерази І добудовує 3'-кінці, приєднуючи радіоактивно мічені нуклеотиди – у результаті 3'-кінці обох ланцюгів містять мітку. Щоб позбавитись однієї з них, використовують сайт другої рестриктази, який все ще залишається всередині. Нарешті маємо мітку на 3'-кінці тільки матричного ланцюга (який із ланцюгів є матричним, треба знати при підборі рестриктаз або встановити за кінцевим результатом). Денатурація цього фрагмента дає радіоактивно-мічений одноланцюговий зонд, для якого є точно відомими його довжина й локалізація в гені. На останніх етапах проводять гібридизацію цього зонда із сумарним препаратом клітинної РНК у розчині – комплементарна частина відповідної мРНК утворює із зондом подвійну спіраль. Після цього й використовують нуклеазу S1, яка здатна гідролізувати тільки одноланцюгову нуклеїнову кислоту. Для локалізації кінцевої точки транскрипції залишається визначити точну довжину отриманого міченого фрагмента ДНК за допомогою електрофорезу: ця довжина дорівнює відстані від мітки до кінцевої точки. Інтенсивність смуги після

349

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

електрофорезу дає інформацію про транскрипційну активність гена: чим вищою є інтенсивність, тим більше мРНК містилося у препараті, виділеному із клітини.

Закінчення транскрипції

Hind III

5'

Рис. 11.12. S1-картування точки закінчення транскрипції

Так само, підібравши інші рестриктази та здійснивши на відповідному етапі мічення 5'-кінців, можна визначити стартову точку транскрипції.

Подовження праймера (primer extension) – альтернативний метод визначення стартової точки. Для його реалізації необхідно знати будьяку невелику послідовність усередині кодуючої частини гена й синтезувати відповідний праймер, помітивши його (рис. 11.13). Праймер додається до сумарної мРНК і гібридизується з нею, після чого здійснюється реакція зворотної транскрипції. Синтез ДНК зворотною транскриптазою припиняється на 5'-кінці мРНК, який і відповідає стартовій точці. Електрофорез у денатуруючих умовах дозволяє точно встановити довжину фрагмента, тобто локалізувати стартову точку відносно місця гібридизації праймера. Як і у випадку S1-картування, інтенсивність електрофоретичної смуги дозволяє оцінити кількість мРНК у препараті, тобто рівень транскрипційної активності.

350

Розділ 11. Методи молекулярної біології

Старт

транскрипції

5'

5' мРНК

Гібридизація з міченим праймером

Зворотна

транскрипція

Денатурація, електрофорез

Рис. 11.13. Метод подовження праймера для визначення старту транскрипції

Визначення транскрипційної активності in vivo. Описані ме-

тоди визначають рівень присутності мРНК певного типу в клітині. Цей рівень залежить не тільки від рівня транскрипційної активності, але й від швидкості деградації мРНК. Один із методів, який дозволяє встановити, чи відбувається транскрипція в даний момент, полягає в тому, що клітинні ядра виділяються і до них додаються мічені нуклеозидтрифосфати. Нові акти ініціації транскрипції вже не відбуваються в таких відокремлених ядрах, і РНК-полімераза просто продовжує добудовувати транскрипти, синтез яких розпочався до виділення. Зрозуміло, що такі подовжені транскрипти виявляються міченими. Після виділення РНК їх треба ідентифікувати, що можна зробити шляхом гібридизації з ДНК генів, які цікавлять дослідника.

Аналіз експресії геному

Проаналізувати повну програму транскрипції організму чи клітин певного типу за певних фізіологічних умов або у процесі розвитку, а також вирішувати інші завдання, пов'язані з вивченням функціонування цілого геному, дозволяють методи, що базуються

351

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

на використанні так званих ДНК-мікроареїв (DNA-microarrays) або ДНК-чіпів (DNA-microchips).

Фрагмент ДНК довжиною до 1 тис. пар основ, для якого відомо його розташування в геномі, ампліфікується, і одноланцюгові продукти ампліфікації пришивають до невеликої зони на поверхні предметного скла мікроскопа. Скло розміром 2 × 2 см – ДНК-мікроарей – покрито сіткою ~6 тис. таких мікроплям, кожна з яких містить ДНК певної геномної ділянки. На поверхні ДНК-чіпів синтезуються короткі (до 20 нуклеотидів) олігонуклеотиди: кілька олігонуклеотидів, які походять із однієї ділянки геному, синтезуються поряд. Таким чином, невелика зона містить ДНК, комплементарну індивідуальній геномній ділянці.

Одну з типових схем використання мікроарея зображено на рис. 11.14. Сумарна мРНК, отримана з клітин певного типу, використовується як матриця в реакції зворотної транскрипції. Поряд зі звичайними, до реакційної суміші додається флуоресцентний аналог одного з NTP.

Сумарна мРНК

Зворотна транскриптаза + флуоресцентний аналог

NTP

кДНК

ДНК-мікроарей

Рис. 11.14. Аналіз сумарної мРНК за допомогою ДНК-мікроарея

352

Розділ 11. Методи молекулярної біології

У результаті отримують препарат флуоресцентно міченої кДНК. Після гібридизації з цією кДНК мікроарей аналізують за допомогою флуоресцентного мікроскопа: наявність флуоресцентної плями свідчить про активність певного гена, інтенсивність флуоресценції – про рівень цієї активності.

Експерименти такого типу дозволяють з'ясувати зміни загальної програми експресії генів при змінах зовнішніх умов, активність різних генів у різних тканинах багатоклітинного організму, зміни активності груп генів у процесі диференціювання клітин. Техніка ДНК-мікроареїв широко використовується також у дослідженнях ДНК-білкових взаємодій.

Методи дослідження ДНК-білкових взаємодій

Вивчення тонких механізмів білково-нуклеїнових взаємодії є здебільшого доступним для різноманітних фізичних методів (див. нижче). У цьому підрозділі описано підходи, що дозволяють встановити сам факт взаємодії та з'ясувати локалізацію певного білка на ДНК in vitro та in vivo.

Гель-електрофорез білково-нуклеїнових комплексів

Оскільки рухливість макромолекул при електрофорезі залежить від їхньої маси та форми, факт зв'язування певного білка з певним фрагментом ДНК легко встановити за допомогою шифт-тесту (shift assay). Принцип методу є дуже простим: ДНК-білковий комплекс (якщо він утворюється) суттєво гальмується в гелі порівняно з вільною ДНК, що приводить, як правило, до наявності двох смуг ДНК після електрофорезу (рис. 11.15, а).

При цьому, якщо білок, як це часто буває, вигинає ДНК у сайті взаємодії, рухливість комплексу буде залежати від позиції білка на фрагменті ДНК: максимальну рухливість мають комплекси, у складі яких білок розташований на одному з кінців фрагмента, мінімальну – ті, де білок займає центральну позицію (рис. 11.15, б). Причиною цієї закономірності є те, що довші (і тому рухливіші) кінцеві ділянки вільної ДНК легше проходять через пори гелю. Відповідно, це дозволяє оцінити локалізацію білка відносно кінців фрагмента ДНК або розділити комплекси, що розрізняють за такою локалізацією.

353

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Білок

Комплекс

Вільна ДНК ДНК

Рис. 11.15. Гальмування рухливості ДНК-білкового комплексу при гель-електрофорезі (а) та залежність ступеня гальмування

від позиції білка на ДНК у випадку вигину ДНК на поверхні білка (б)

Футпринтинг

Іншим підходом, який використовують для точної локалізації білка на фрагменті ДНК, є футпринтинг ДНК (DNA footprinting). Принцип методу схематично зображено на рис. 11.16. Кінець одного з ланцюгів мітять радіоактивною міткою. Зазвичай 32Р у складі фосфатного залишку приєднується до попередньо дефосфорильованих 5'-кінців полінуклеотидкіназою, після чого один із кінців фрагмента відрізається рестриктазою (аналогічно відповідному етапу процедури на рис. 11.12). Якщо внести в цю ДНК обмежену кількість одноланцюгових розрізів (наприклад, один розріз на фрагмент у середньому), отримаємо випадковий набір мічених фрагментів різної довжини, який можна розділити за допомогою гель-електрофорезу в денатуруючих умовах. Як агенти, що вносять розриви, найчастіше використовують ДНКазу І або гідроксил-радикали: обидва агенти розрізають один з ланцюгів ДНК через маленький жолобок. У випадку, коли з фрагментом ДНК взаємодіє білок, ДНК виявляється захищеною в сайті взаємодії: на гелі після електрофорезу можна побачити зону, де відсутні смуги ДНК, або інтенсивність смуг є нижчою порівняно з контрольним результатом деградації вільної ДНК. Довжини верхньої та нижньої смуг, які оточують цю зону, є межами сайта взаємодії відносно мітки.

Аналогічний підхід у комбінації з блот-гібридизацією (так зване непряме кінцеве мічення) дозволяє встановити ступінь захищеності ДНК білками в конкретних геномних зонах. Першим етапом процедури є обмежена деградація ДНК нуклеазою у клітинних ядрах. Після цього

354

Розділ 11. Методи молекулярної біології

виділяють сумарну ДНК і обробляють її рестриктазою: у результаті препарат містить фрагменти ДНК від рестриктного сайта до місця розрізу нуклеазою. Усі ці фрагменти розділюють шляхом електрофорезу, здійснюють блотинг і обробляють нітроцелюлозний фільтр радіоактивно міченим зондом до певної ділянки генома. На авторадіограмі візуалізуються (або ні, якщо ДНК захищена білком) фрагменти ДНК з цієї зони.

Радіоактивна

мітка

Одноланцюгові

розрізи

Білок

ДНК

Гель-електрофорез у денатуруючих умовах

Рис. 11.16. Футпринтинг ДНК у складі білково-нуклеїнового комплексу

Імунопреципітація хроматину

Метод імунопреципітації (ChIP – Chromatin ImmunoPrecipitation)

є потужним засобом установлення наявності білка на певній ділянці ДНК in vivo (рис. 11.17). Для цього клітини обробляють формальдегідом із метою ковалентного пришивання всіх білків до ДНК. Далі здійснюють лізис клітин, виділяють ДНК і частково її фрагментують. Ковалентні ДНК-білкові комплекси осаджують антитілами, специфічними до конкретного білка (або пропускають через колонку, на якій іммобілізовані антитіла). Отримані комплекси руйнують, видаляючи зшивку хімічним шляхом, і аналізують ДНК, яка була зв'язаною у клітині з даним білком.

Одним із варіантів аналізу може бути ампліфікація ДНК за допомогою ПЛР і наступне секвенування або гібридизація з міченим зондом. Якщо, наприклад, зробити зшивання в різні моменти після регуляторного сигналу, то можна встановити послідовність зв'язування білків з регуляторними ділянками промотора певного гена.

355