MolBiol_sivolob

Розділ 8. Синтез білків

f-Met-тРНКі

IF2•GDP

Рис. 8.27. Послідовність основних подій при ініціації трансляції у прокаріотів

Зв'язування названих трьох елементів, яке приводить до утворення преініціаторного комплексу, відбувається незалежно один від одного і в будь-якому порядку, зокрема ініціаторна тРНК взаємодіє з преініціаторним комплексом незалежно від стартового кодона. Наступним кроком є впізнання кодона антикодоном у Р-сайті, полегшуване факторами IF2 і IF3. Утворення кодон-антикодонової подвійної спіралі індукує конформаційну зміну маленької субодиниці, унаслідок якої відбувається звільнення факторів IF1, IF3 і зв'язування великої рибосомної субодиниці. Взаємодія між великою субодиницею та IF2 індукує GTPазну активність останнього: відбувається гідроліз GTP та дисоціація IF2.

У результаті система трансляції є готовою для першого елонгаційного циклу: А-сайт напоготові прийняти аа-тРНК з другою амінокислотою поліпептидного ланцюга, на яку при транспептидації буде перенесено f-Met з ініціаторної тРНК.

255

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Ініціація трансляції в еукаріотів

Еукаріотична рибосома поза процесом трансляції також дисоційована на дві субодиниці, завдяки взаємодії маленької з фактором eIF3 (складається з 9–11 субодиниць). Крім того, дисоційований стан субодиниць підтримується кількома іншими факторами, що взаємодіють з маленькою (eIF3С) і великою (eIF6) субодиницями. З комплексом маленька субодиниця – eIF3 зв'язується потрійний комплекс ініціаторна метіонінова тРНК – eIF2·GTP (eIF2 є аналогом фактора елонгації eEF1).

Рис. 8.28. Послідовність основних подій при ініціації трансляції в еукаріотів.

Паралельно (рис. 8.28) відбувається впізнання кепа на 5'-кінці мРНК факторами ініціації групи eIF4: субодиниця eIF4E зв'язується з кепом, eIF4G є структурним модулем, що забезпечує цілісність комплексу та його взаємодію з іншими елементами ініціації, eIF4A є АТР-залежною РНК-геліказою, фактор eIF4В (не показаний на рис. 8.28)

256

Розділ 8. Синтез білків

взаємодіє з мРНК, стимулює АТРазну активність гелікази і при скануванні мРНК бере участь у впізнанні стартового кодона.

Наступним кроком є об'єднання кеп-асоційованого комплексу з таким, що асоційований з маленькою субодиницею (ініціаторна тРНК має бути присутньою на маленькій субодиниці, щоб ця остання могла приєднатися до кепу). Ефективність утворення цього преініціаторного комплексу на кепі підсилюється за рахунок взаємодії polyA-зв'язаних білків (PABP) з eIF4G: polyA-послідовність на 3'-кінці мРНК також приєднується до преініціаторного комплексу, замикаючи мРНК у кільце.

Далі за рахунок геліказної активності eIF4A преініціаторний комплекс (залишаючи на кепі лише eIF4E) починає транслокацію: eIF4A здійснює гідроліз АТР і пересувається вздовж мРНК у напрямку до 3'-кінця, одночасно руйнуючи дволанцюгові шпильки, якщо вони зустрічаються. Під час транслокації преініціаторний комплекс сканує послідовність мРНК, перевіряючи її на наявність стартового кодона. Зовсім не обов'язково при цьому перший кодон AUG, що зустрічається, сприймається як стартовий. Упізнання стартового кодона залежить від контексту послідовності, в якій він розташований. Найкращим контекстом, який максимально сприяє ініціації трансляції, є так звана послідовність Козак (Marilyn Kozak): GCC(A/G)CCAUGG.

Упізнання стартового кодона викликає відповідні конформаційні зміни комплексу, звільнення факторів eIF3 і eIF4 (останній повертається на кеп разом polyA-ділянкою мРНК), приєднання великої рибосомної субодиниці та дисоціацію eIF2·GDP після гідролізу GTP. Дисоціація eIF3 і eIF2 полегшується фактором eIF5. Рибосома після цього вступає в етап елонгації трансляції, а на кепі починається збирання наступної рибосоми.

Таким чином, на мРНК одночасно працює кілька рибосом, які утворюють так звану полісому (рис. 8.29). Зациклення полісоми: 1) сприяє залученню зруйнованої при термінації трансляції у 3'-кін- цевій зоні мРНК рибосоми до нового раунду ініціації; 2) забезпечує додатковий захист 3'-кінця мРНК (унаслідок його взаємодії з кепасоційованим комплексом) від нуклеазної деградації; 3) підвищує надійність системи трансляції – оскільки деградація мРНК може розпочинатися тільки з 3'-кінця (див. розділ 7), лише повноцінні матриці, що містять polyA-послідовність (і автоматично – кодуючу частину) залучаються до білкового синтезу.

257

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ААААА

кеп

Рис. 8.29. Циркулярна полісома

Термінація трансляції

Термінація білкового синтезу здійснюється за подібною для прота еукаріотів схемою (рис. 8.30). Коли після чергового елонгаційного циклу (який стане останнім) в А-сайті опиняється один із трьох стопкодонів, він упізнається фактором термінації трансляції RF1 або RF2 (RF – Release Factor) – жодна тРНК не містить відповідних антикодонів. Цей фактор рекрутує до рибосоми комплекс RF3·GTP (аналог EF1). Під дією останнього спрацьовує пептидилтрансферазний центр рибосоми, намагаючись здійснити перенесення пептидилу. Оскільки в А-сайті немає звичайного субстрату транспептидації, відбувається перенесення на молекулу води – гідроліз зв'язку С-кінцевої амінокислоти з рибозою у складі пептидил-тРНК. На цьому закінчується власне термінація трансляції – з рибосоми звільняється поліпептид. Наступні події стосуються вже підготовки рибосоми до нового раунду трансляції.

Після гідролізу GTP здійснюється дисоціація факторів термінації та зв'язування замість них фактора відновлення рибосоми RRF (Ribosome Recycling Factor) і фактора елонгації EF2 в комплексі з GTP.

Сумісна дія цих факторів у координації з гідролізом GTP спричиняє дисоціацію рибосомних субодиниць. Із маленькою субодиницею замість дисоційованих RRF і EF2 зв'язується фактор ініціації трансляції IF3 (який, таким чином, можна вважати також і фактором термінації). IF3 сприяє визволенню тРНК і мРНК з маленької субодиниці й запобігає взаємодії між субодиницями. У результаті субодиниці рибосоми знов можуть залучитися до ініціації трансляції.

258

RRF

IF3

Рис. 8.30. Послідовність основних подій при термінації трансляції

Регуляція трансляції

Прокаріотична мРНК має досить невеликий час життя – практично вона існує під час транскрипції та відразу після неї. Регуляція експресії гена у прокаріотів здійснюється переважно на рівні транскрипції (хоча білковий синтез може бути залученим до такої регуляції – див. розділ 5). Для еукаріотів регуляція трансляції є, навпаки, дуже важливим окремим елементом загальної регуляції експресії.

Регуляція на рівні ініціації трансляції – це один із найважли-

віших механізмів. Ефективність ініціації трансляції залежить насамперед від:

•Контексту послідовності, в якій знаходиться стартовий кодон – відхилення цього контексту від послідовності Козак (див. вище) утруднює впізнання стартової точки і, відповідно, зумовлює необхідність позитивної регуляції.

259

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

•Відстані стартового кодона від 5'-кінця мРНК – довге сканування матриці під час ініціації підвищує ймовірність руйнування преініціаторного комплексу.

•Наявності / відсутності дволанцюгових шпильок у 5'-кінцевій зоні мРНК, що не транслюється (див. рис. 7.10), які гальмують процес сканування.

•Присутності / відсутності регуляторних білків, які зв'язуються

у 5'-кінцевій зоні.

Крім того, у деяких випадках (РНК пікорнавірусів, мРНК факторів росту фібробластів) процес ініціації відбувається за ефективним внутрішнім механізмом незалежно від сканування: завдяки наявності особливих послідовностей (IRES – Internal Ribosome Entry Site), що безпосередньо впізнаються елементами системи ініціації.

Один із прикладів участі білків у негативній регуляції ініціації трансляції наведено на рис. 8.31. Білок, який утримує залізо в клітині – феритин – має з'являтися негайно після проникнення в цитоплазму цього необхідного, але отруйного у вільному вигляді мікроелемента. Тому мРНК феритину завжди міститься в цитоплазмі, у відсутності заліза – у неактивному стані. Інактивація забезпечується за рахунок зв'язування репресора (який блокує процес сканування) зі шпилькою у 5'-кінцевій зоні.

Аконітаза

AAAAAA

Fe Феритин

AAAAAA

Рис. 8.31. Регуляція синтезу феритину

Як репресор виступає аконітаза (один із ферментів циклу Кребса (Hans Adolf Krebs)). При появі заліза воно зв'язується аконітазою, що викликає звільнення аконітази від мРНК і, як наслідок, активацію

260

Розділ 8. Синтез білків

трансляції феритину. Синтезований феритин зв'язує залізо, забираючи його в аконітази, яка повертається на мРНК і зупиняє трансляцію.

Мішенню глобальної регуляції на рівні ініціації є також фактори ініціації. Наприклад, фосфорилювання / дефосфорилювання eIF-2 приводить, відповідно, до його деактивації / активації.

Крім регуляторних білків, до регуляції трансляції залучаються також маленькі РНК. Серед них є такі, що мають стимулюючий вплив на трансляцію: РНК деяких вірусів, РНК-продукти транскрипції Alu-повторів гальмують фосфорилювання eIF-2, сприяючи активації трансляції. Молекули мікроРНК (див. розділ 6), навпаки, гальмують трансляцію (частіше на етапі сканування матриці) за рахунок комплементарної взаємодії з мРНК.

Елонгація трансляції також є мішенню регуляторних впливів. Швидкість елонгації варіює в досить широких межах відносно середнього значення, іноді рибосома може зупинятися на певний час. Паузи відбуваються на кодонах, які відповідають мінорним тРНК, зміна концентрації яких є одним зі шляхів регуляції швидкості трансляції. Підвищення загальної швидкості трансляції пов'язане з адаптацією наборів аа-тРНК – узгодженням між частотою найуживаніших кодонів і відповідних ізоакцепторних тРНК.

Наявність шпильок усередині кодуючої частини мРНК також гальмує елонгацію, як і репресори, які впізнають елементи послідовності мРНК.

Однією з мішеней регуляції є також фактори елонгації, котрі (як і фактори ініціації) піддаються певним модифікаціям, що зумовлюють активацію / інактивацію факторів. Екстремальний приклад – дифтерійний токсин, який інактивує фактор eEF-2 і повністю вимикає білковий синтез.

Особливим випадком є включення в кілька важливих білків (присутні в усіх організмів ферменти, що належать до класу оксидоредуктаз) модифікованої амінокислоти селеноцистеїну (яка є елементом активного центру цих ферментів). Селеноцистеїнова тРНК (продукт особливого тРНК-гена) здатна впізнавати внутрішній стоп-кодон UGA, фланкований (у напрямку до 3'-кінця) специфічною шпилькою. Ця тРНК спочатку акцептує Ser, який далі перетворюється на селеноцистеїн відповідними ферментами (відбувається заміна ОН-групи на групу SeH, див. рис. 2.2). Селеноцистеїн-тРНК зв'язується зі специфічним аналогом елонгаційного фактора EF1 (позначається як SelB у прокаріотів і як SECIS в еукаріотів). Шпилька в мРНК упізнається або самим цим специфічним фактором елонгації (прокаріоти), або ще одним

261

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

білком, з яким цей фактор елонгації взаємодіє (еукаріоти), що й забезпечує зв'язування селеноцистеїн-тРНК з А-сайтом рибосоми.

Зміна часу життя мРНК – ще один шлях регуляції трансляції. Час життя мРНК у цитоплазмі залежить головним чином від ступеня захищеності 3'-кінця від екзонуклеаз (оскільки кеп є нечутливим до нуклеаз). Досить типову ситуацію ілюструє приклад регуляції трансляції іншого білка, який має відношення до обміну заліза, – рецептора трансферину (рис. 8.32).

AAAAAA

Fe

Аконітаза

Fe

Нуклеаза

Рис. 8.32. Регуляція синтезу рецептора трансферину

Трансферин є позаклітинним переносником заліза, транспорт заліза в цитоплазму залежить від кількості рецепторів трансферину в мембрані. У відсутності заліза всередині клітини на мРНК рецептора здійснюється синтез білка, мРНК при цьому стабілізована: аконітаза зв'язана зі шпильками в 3'-кінцевій зоні, що блокує нуклеазну деградацію. Зростання концентрації заліза викликає дисоціацію аконітази, і починається швидка деградація мРНК.

Формування просторової структури білка

Термінація білкового синтезу на рибосомі не означає утворення функціонально активної молекули білка. Серед різних важливих операцій, яким піддається синтезований поліпептидний ланцюг, слід згадати такі, що їх можна об'єднати під назвою білкового процесингу – дозрівання поліпептидного ланцюга.

262

Розділ 8. Синтез білків

•Часткова протеолітична деградація – відщеплення кінцевих ділянок ланцюга, частіше на N-кінці, або іноді розрізання ланцюга на окремі фрагменти. Часткова деградація є особливо характерною для секреторних білків і ферментів, які мають гідролітичні активності, – така деградація переводить білок у активну форму.

•Утворення дисульфідних містків – ковалентних S-S-зв'язків між двома наближеними у просторі залишками Cys. Формування містків прискорюється спеціальним ферментом – дисульфідізомеразою.

•Ковалентні посттрансляційні модифікації амінокислотних залишків (фосфорилювання, ацетилювання, глікозилювання тощо), приєднання полісахаридів, ліпідів, простетичних груп і кофакторів небілкової природи.

•Білковий сплайсинг – досить екзотична операція, описана для кількох десятків білків різних таксономічних груп, від бактерій до хребетних. У процесі такого сплайсингу центральна частина ланцюга (інтеїн) вирізається, а два кінцеві фрагменти (екстеїни) зшиваються між собою в автокаталітичній реакції. Реакція не потребує не тільки зовнішнього ферменту, а й джерела енергії:

подібно до сплайсингу мРНК (розділ 7), білковий сплайсинг здійснюється шляхом заміни одних зв'язків іншими.

Кожна з названих операцій не є універсальною. Проте будь-який поліпептидний ланцюг, незалежно від того, потребує він процесингу чи ні, має сформувати просторову структуру для набуття певної активності (зрозуміло, що не йдеться про неструктуровані білки, згадані в розділі 2).

Закономірності укладання білкової глобули

Перше й головне твердження щодо процесу укладання поліпептидного ланцюга в нативну глобулу полягає в тому, що просторова

структура нативного білка і шлях її формування повністю визначаються амінокислотною послідовністю, і тільки амінокислотною послідовністю.

Процес укладання білка в нативну структуру – це пошук конформації, яка відповідає мінімуму вільної енергії для даної послідовності амінокислот, і, відповідно, є найстабільнішою. Певне уявлення про своєрідний “енергетичний ландшафт”, що відповідає загальному набору різноманітних конформацій амінокислотного ланцюга, дає рис. 8.33 (зрозуміло, що насправді кількість конформаційних коорди-

263

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

нат значно більше двох – конформаційний простір є багатовимірним). Нативна структура глобулярного білка завжди відокремлена від інших конформацій особливо глибоким мінімумом – знаходиться в енергетичній ямі (рис. 8.33). Наявність такої ями, яка відповідає стабільному щільно упакованому гідрофобному ядру (див. розділ 2), забезпечує надійність функціонування білка: теплові флуктуації не здатні вивести структуру з такої ями.

Величезна кількість конформацій, у принципі доступних для поліпептидного ланцюга, поставила проблему, відому як парадокс Левінталя (Cyrus Levinthal). Якщо кожен амінокислотний залишок має ~10 конформацій, ланцюг зі 100 залишків – 10100 конформацій. За найнижчою оцінкою перемикання однієї конформації відбувається за ~10–13 с, тобто, щоб перебрати всі конформації потрібно щонайменше 1080 років, що значно перевищує вік Всесвіту. Аналогія конформаційного простору з ландшафтом (рис. 8.33) відразу дає рішення цього парадоксу: річка не перебирає увесь ландшафт, вона просто тече одним або кількома альтернативними низькими руслами, впадаючи врештірешт у найнижчу яму.

Так само й для поліпептидного ланцюга існують певні “виділені” шляхи укладки, які відповідають ієрархії структури білка (див. розділ 2). Спочатку за рахунок локальних взаємодій утворюються елементи вторинної структури з гідрофобними поверхнями. Водночас завдяки гідрофобних взаємодій вони “злипаються” між собою, утворюючи розплавлену глобулу. Цей процес відбувається досить швидко – за кілька мікросекунд. На другому етапі, який потребує значно більшого часу (кілька секунд чи навіть хвилин), реалізується щільна упаковка глобули за рахунок вандерваальсових взаємодій з утворенням твердої нативної молекули, що відповідає глобальному мінімуму вільної енергії. Конформація ланцюга змінюється, прямуючи через локальні мінімуми енергії, які відокремлені один від одного невисокими бар'єрами. Бар'єри легко долаються за рахунок теплових флуктуацій, і ланцюг нарешті опиняється у глибокому глобальному мінімумі. Але на такому шляху можливі енергетичні пастки (рис. 8.34) – досить глибокі мінімуми, з яких неможливо вибратися за розумний час, оскільки глибина такої локальної ями перевищує енергію теплових флуктуацій.

Однією з головних причин виникнення енергетичних пасток є агрегація поліпептидних ланцюгів. У стані розплавленої глобули, яка відрізняється від нативної великомасштабними рухами своїх частин, час від часу відбувається вихід на поверхню значної частини гідрофобних залишків. Відповідно, недоструктуровані поліпептидні ланцюги будуть

264