4 курс / Общая токсикология (доп.) / Obschaya_ikhtiotoxikologia_Lukyanenko

фосфамид, форат, параоксан, дельнав, ДДВФ) вызывали различный по выраженности и длительности антихолинэстеразный эффект у 16 исследованных видов рыб. Только в одном из известных нам сообщений автору [767] не удалось обнаружить отрицательного влияния фосфорорганического пестицида на активность АХЭ мозга рыб (ушастый окунь, сомик-кошка).

Сходство реакции рыб и теплокровных животных на фосфорорганические пестициды проявляется не только в самом факте ингибирования АХЭ мозга, но и в скорости развития этого эффекта. Снижение активности АХЭ мозга рыб происходит в первые часы контакта рыб с ядохимикатами задолго до летального исхода [841, 842, 494, 423, 3]. Выраженность антихолинэстеразного эффекта, вызываемого фосфорорганическими пестицидами, у рыб находится в прямой зависимости от концентрации ядохимиката и времени его действия [3]. Летальные концентрации фосфорорганичеоких пестицидов вызывают более глубокое угнетение АХЭ мозга рыб, чем сублетальные [496, 497]. Эти данные противоречат высказанной ранее [562] точке зрения о том, что не существует корреляции между концентрацией фосфорорганичеоких пестицидов и степенью угнетения активности АХЭ мозга рыб.

Разумеется, строгой корреляции между концентрацией и любым токсическим эффектом того или иного вещества ожидать нереально, поскольку токсикологи имеют дело с живыми организмами, исходное состояние которых определяется десятками факторов, и «уравнять» их практически невозможно. Тем не менее имеющиеся сегодня экспериментальные данные однозначно свидетельствуют о том, что высокие концентрации фосфорорганических пестицидов вызывают более глубокое и быстро наступающее угнетение активности АХЭ мозга рыб, чем более низкие.

Итак, фосфороргаиичеекие пестициды вызывают быстроразвивающееся угнетение активности АХЭ мозга рыб, но с более или менее длительным последействием. Восстановление исходного уровня активности АХЭ мозга в случае прекращения контакта рыб с пестицидом происходит в течение 8-30 сут [842, 748, 3].

Эти общие закономерности влияния фосфороргани-чееких пестицидов на АХЭ мозга рыб, выявленные экспериментальным путем, послужили основанием для использования фермента, уровня его активности в качестве биохимического критерия токсичности данной группы веществ и даже для оценки уровня загрязнения водных экосистем в США [493, 494]. Правда, возникли разногласия относительно того, где именно рассматривать активность ацетилхолинэстеразы: в мозг» или в плазме крови, но «и у кого не возникает сомнений в том, что активность этого фермента представляет собой чувствительный биохимический тест токсического действия фосов на рыб.

Изучение холинэстсразы крови рыб, отравленных различными фосфорорганическими пестицидами, началось практически одновременно с работами по АХЭ мозга. В одном из первых сообщений Р. Эйслера [539] показано, что при полуторамесячной экспозиции метилпаратион почти полностью угнетает холинэстеразу крови иглобрюха. Ингибпрование холинэстсразы крови рыб различными фосфорорганическим и пестицидами отмечали и другие авторы [761, 765, 564, 495]. Отечественные работы по этому вопросу стали проводиться в конце 60-х — начале 70-х годов. Согласно данным, опубликованным В. В. Метелевым [227], фоофорорганичеокие пестициды (метилвитрофос, фосфамид, трихлормета-фос-3) оказывают ингибирующее действие на активность АХЭ крови, а также печени и мышц некоторых видов рыб.

Так, субтоксическая концентрация фосфамида снижает активность АХЭ крови на 55%, а токсическая — на 72% (время наблюдений не указано). Метилнитрофос ингибирует этот фермент в крови на 62,9 и 68,8%, а в мышцах и в печени — на 100% (экспозиция 96 ч). Автор приходит к выводу, что отравление рыб фосфорорганическими пестицидами может быть диагностировано по степени угнетения АХЭ крови прижизненно, а печени и мышц — посмертно.

В работе Л. И. Грищенко и др. [71] представлены экспериментальные данные, свидетельствующие о наличии четко выраженной корреляционной зависимости антихолинэстразного эффекта одного из фосфорорганических пестицидов — бензофосфата — от концентрации вещества и времени его действия на рыб.

Острое отравление карпов (концентрация бензофосфата 1,2 мг/л) приводило к резкому (на 82%) снижению активности АХЭ крови уже через 3 ч. Интересные данные получены в подострых и хронических опытах. Концентрация 0,04 мг/л бензофосфата (1/30 ЛК50) вызывала угнетение АХЭ крови в течение 1 сут на 27,5%, 6 сут

— на 49,0%, 30 сут — на 55,9% и 70 сут — на 74,1% активности АХЭ крови у контрольных рыб. Увеличение концентрации токсиканта до 0,06 мг/л (1/30 ЛК50) в те же сроки наблюдений привело к еще более резкому снижению активности фермента — на 48,3; 73,0; 85,0; 89,0% соответственно. Новое четырехкратное увеличение концентрации бензофосфата до 0,24 мг/л (1/30 ЛК50) вызвало уже через сутки ингибпрование активности АХЭ крови на 85,5%, через 6 сут — на 77%, через 15 сут — на 100% и через 30 сут — на 84,2%. Как при остром, так и при хроническом отравлении обнаружена тесная связь между степенью угнетения активности АХЭ крови и гибелью подопытных рыб.

Обстоятельное изучение динамики изменения активности АХЭ крови под влиянием ряда фосфорорганических пестицидов (базудин, байтекс, метафос, ДДВФ) выполнено II. Р. Косиновой [135].

Основным объектом исследования служил ка'рп. Длительность острых опытов 48 ч, хронических — 20-30 сут. Наиболее существенные изменения активности АХЭ крови отмечены на 5-е сутки. К этому сроку активность фермента у рыб, отравленных базудином (0,1 мг/л), составляла 68% контроля, байтексом — 85% и метафосом — 04%. Затем происходит иекоторое увеличение активности фермента (10-15-е сутки), которое сменяется вторичным угнетением иа 20-е сутки наблюдений. Автор отмечает наличие прямой коррелятивной связи между концентрацией препарата и его антнхолинэстразным эффектом. Снижение активности АХЭ отмечено также в

печени и мышцах. И в том, и в другом случае оно менее выражено, чем в крови. Например, при ингибнровании фермента в крови на 40-50%, в печени и мышцах этих же рыб его активность снижается не более чем на 30%.

В работе В. И. Козловской и Г. М. Чуйко [121] предпринята попытка выявить наличие связи между общей устойчивостью рыб (лещ, синец, плотва и карп) к одному из фосфорорганических пестицидов — хлорофосу — и чувствительностью сывороточной холинэстеразы (шифр 3.1.1.8) к этому пестициду. Сама по себе такая постановка вопроса является несколько неожиданной. Ацетилхолинэстераза, по мнению С. Н. Голикова и В. Н. Розеигарт [62], «не является типичной для сыворотки крови», и потому даже полная инактивация этого фермента не должна повлечь за собой гибель организма. Еще в большей степени сказанное относится к сывороточной холинз-стеразе, функции которой вообще неясны даже у теплокровных животных, не говоря уже о рыбах. Повидимому, это «вспомогательный» фермент [282, 817], активность которого можно безболезненно снизить до нуля [320].

Всерии опытов по идентификации авторы установили, что «холинэстеразы сыворотки крови карпа, леща,

атакже плотвы и синца с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП), равной 0,07, по своим свойствам ближе к ацетилхолинэстеразе, чем ферменты плотвы (ОЭП 0,26) и синца (ОЭП 0,29) — холинэстеразе» (121, с. 37). По данным опытов, большей чувствительностью к хлорофосу обладает фермент со свойствами холинэстеразы, имеющийся у плотвы и синца, устойчивость которых к хлорофосу (ЛК100 равна 60 и 70 мг/л соответственно) значительно ниже устойчивости карпа (ЛК100 равна 500 мг/л) и леща (ЛК100 равна 200 мг/л).

На основе этих данных авторы приходят к выводу, что «устойчивость изучаемых видов (плотва, лещ, синец, карп) коррелирует с чувствительностью их ферментов к токсиканту» [121, с. 39]. Однако нам такой вывод представляется неправомерным. Ведь у леща и карпа фермента со свойствами холинэстеразы нет, т. е. можно сказать, его активность нулевая, и они прекрасно обходятся без него. Почему же, например, у синца,

систематически близкого лещу, снижение активности этого фермента должно послужить причиной гибели? Известно, что активность сывороточной холинэстеразы можно снизить до нуля без видимых патологических последствий [320]. Словом, удовлетворительного ответа на этот вопрос без исследований, направленных «а выяснение функций сывороточной холинэстеразы у рыб, получить нельзя. Что касается чувствительности другого сывороточного фермента — ацетилхолинэстеразы, то она у карпа и леща оказалась практически одинаковой. Между тем если судить по абсолютно летальной концентрации хлорофоса, то устойчивость карпа в 2,5 раза выше устойчивости леща. Более того, чувствительность ацетил-холинэстеразы к хлорофосу у плотвы и синца мало отличается от чувствительности ацетилхолинэстеразы у леща и карпа, а устойчивость плотвы и синца примерно в 7 раз ниже, чем у карпа, и в 3 раза ниже, чем у леща. Авторы игнорируют расхождения между степенью чувствительности ацетилхолинэстеразы у четырех видов карповых и степенью их устойчивости к хлорофосу. А ведь точкой приложения — «мишенью» фосфорорганических пестицидов является именно ацетилхолинэстераза.

Исследования показывают, что далеко не всегда имеется корреляция между степенью угнетения ацетилхолинэстеразы и холинэстеразы крови и выраженности интоксикации рыб, а тем более степенью устойчивости рыб.

Однако это обстоятельство, разумеется, не может служить помехой для использования активности ацетилхолинэстеразы крови в качестве чувствительного биохимического теста токсичности пестицидов. Сказанное в равной мере относится и к возможности использования АХЭ мозга, хотя и здесь отмечены случаи отсутствия корреляции между концентрацией пестицида и степенью ингибироваиия этого фермента [562]. Конечно, кровь доступнее для анализов, чем, скажем, мозг или печень, и ее можно исследовать на разных этапах эксперимента у одной и той же рыбы [761, 564], но при этом следует учитывать, что функциональное значение АХЭ мозга и крови далеко не равнозначно для организма. Поэтому мы считаем, что дискуссия относительно того, в каком органе или какой ткани исследовать активность АХЭ при отравлении рыб пестицидами, носит искусственный характер. Значительно более важно, на наш взгляд, оценить критерии токсичности этой группы веществ при исследовании уровня активности фермента, т. е. определить, какая степень угнетения АХЭ должна восприниматься как свидетельство выраженного токсического эффекта.

По мнению Д. Колледжа [493, 494], снижение активности АХЭ мозга на 13% по сравнению с активностью АХЭ мозга контрольных особей отражает токсическое действие пестицидов, а падение ее на 83% приводит к гибели рыб. Сходной точки зрения придерживается Г. Гольдштейи [564]. По его мнению, угнетение активности АХЭ в мозге рыб на 10%, в эритроцитах на 20% и в плазме крови на 33% может служить надежным показателем токсического действия пестицидов на рыб. Напомним, что и у теплокровных животных снижение активности АХЭ эритроцитов на 20-25% отражает развитие токсического процесса. По данным М. Али [3], угнетение активности АХЭ мозга рыб в первые часы контакта с пестицидами на 50% и более является показателем летального исхода в течение 10 сут, а на 30-40% — свидетельствует о развитии токсического процесса. Авторы еще одной работы, выполненной на карпе с токсафеном — одним из хлорорганических пестицидов [667], приходят к выводу, что угнетение АХЭ сыворотки крови на 20-30% указывает на легкую степень отравления рыб, на 50-60% — среднюю и на 80% — на тяжелую степень отравления. Далее мы вернемся к результатам этой работы. Совокупность накопленных к настоящему времени данных однозначно свидетельствует о возможности практического использования активности ацетилхолинэстеразы различных органов и тканей в качестве надежного биохимического критерия токсичности пестицидов, а также для прогностических целей. Остановимся еще на одном, весьма важном, на наш взгляд, вопросе о специфичности антихолинэстразного эффекта фосфорорганических пестицидов у рыб, представляющем не только теоретический, но и практический интерес.

Как мы уже отмечали, в США антихолинэстеразное действие фосов используют не только для оценки степени токсичности того или иного пестицида фосфороргани ческой группы в лабораторных экспериментах, но даже для оценки уровня загрязнения, фосфороргаиичеокими пестицидами водных экосистем [761], т. е. как для биотестирования, так и для биоиндикации. Биотестирование фосфорорганических пестицидов в лабораторных условиях на рыбах с использованием такого чувствительного биохимического теста не вызывает возражений. Однако биоивдикация фосфорорганических пестицидов в естественных водоемах на основе одного лишь этого теста встречает серьезные затруднения. И дело не только в том, что уровень активности АХЭ мозга, крови и других органов и тканей у рыб природных популяций зависит от многих факторов, в том числе от температуры воды в водоеме, а потому широко варьирует [761]. Главная причина заключается в том, что изменение активности АХЭ рыб может быть вызвано и другими токсикантами. В 1963 г. [158, 185] было впервые показано снижение активности холинэстеразы мышечной ткани рыб, подвергшихся острому отравлению фенолом. Результаты этих опытов были впоследствии подтверждены на других видах рыб, отравленных фенолом, а также сернокислым аммонием и медью, причем исследовалась ацетилхолинэстераза мозга [715].

В настоящее время имеется довольно много экспериментальных данных, из которых следует, что активность АХЭ различных органов и тканей рыб может изменяться не только под влиянием фосфорорганических пестицидов, но и под действием других токсикантов, в том числе хлорорганических и карбаматных пестицидов.

Так, в работе В. Литбраски и Г. Литбраски [667] показано, что хлорорганический пестицид токсафен (полихлоркамфен) концентрацией 0,5 и 0,75 мг/л уже через 10 ч после начала опытов вызывал снижение активности АХЭ сыворотки крови карпа на 23-41%, а в эритроцитах — повышение ее на 27-53%. Другой хлорорганический гестицид — ДДТ вызывал угнетение активности АХЭ мозга окуней (на стадии агонии) почти на 50% по сравнению АХЭ мозга контрольных особей [206]. А. Я. Маляревской [206] удалось показать, что такие неспецифические стрессорные воздействия на организм, как гипоксии, приводят к резко выраженному снижению активности АХЭ мозга (па 82-87%) и печенп (на 71-89%) у окуней на стадии агонии. Наконец, синезеленые водоросли и их токсины также вызывают снижение активности АХЭ мозга (у судака на 54%, у язя на 31-63%, у карася на 21—33%, у толстолобика на 37%) и печени (у судака на 47%, у язя на 8-56%, у карася на 14-51%, у толстолобика на 26%). Анализируя полученные данные, А. Я. Малярсвская приходит к вполне обоснованному выводу о том, что угнетение активности холинэстсразы при воздействии перечисленных экстремальных факторов свидетельствует о неспецифичности изменения этого показателя и о возможности применения его для характеристики различных интоксикаций и разнообразных нарушений в организме рыб, связанных с изменением нормального функционирования нервной системы» [206, с. 106].

Влияние хлорорганических пестицидов на активность АХЭ различных органов и тканей отмечает и О. В. Маслова [221] у рыб, отловленных па загрязненных участках Дуная. Определяя наличие остаточных количеств хлорорганических пестицидов в организме рыб, в частности ДДТ, она обнаружила наличие прямой связи между содержанием ДДТ в органе и активностью АХЭ: чем больше ДДТ в том или ином органе рыб, тем ниже активность его АХЭ. Максимальное угнетение этого фермента обнаружено в мозге годовиков леща. Интересно, что активность АХЭ сыворотки крови рыб, в организме которых имеется ДДТ, либо вообще не меняется, либо увеличивается. Так, у хищных рыб из дельты Дуная активность АХЭ крови была достоверно выше (у судака на 63%, у окуня на 54%), чем у этих же видов, отловленных в более чистом Днепровско-Бугском лимане. Такая направленность изменений активности АХЭ сыворотки крови под влиянием хлорорганических пестицидов, отличающаяся от имеющей место при отравлении рыб фосфорорганическими пестицидами, вполне возможна. По нашим неопубликованным данным, полученным совместно с Л. А. Петуховой еще в 1963 г., в результате длительного (до 6 сут) действия сублеталыюй концентрации фенола (5 мг/л) на рыб активность АХЭ крови у подопытных лещей к концу наблюдений (9,79% разложенного ацетилхолина) была значительно выше, чем у контрольных (3,60%). Сегодня трудно дать однозначное объяснение обнаруженным различиям в изменении активности АХЭ сыворотки крови, вызванном фосфорорганическими пестицидами и друтими токсикантами (фенол, ДДТ). Одной из причин могут быть фазовые изменения активности фермента [135], когда первоначальное снижение активности АХЭ вменяется затем се повышением и стабилизацией на новом уровне с последующим резким снижением незадолго до гибели рыб.

Угнетение активности АХЭ мозга рыб отмечено и в опытах с карбаматными пестицидами [266,3], которые, как известно, выступают в роли конкурирующих ингибиторов, не соединяясь непосредственно с ферментом. В опытах М. А. Али [3], выполненных на карпе, изучено антихолинэстеразнос действие двух карбаматных пестицидов: севина и темика. Уже через 2 ч после помещения рыб в раствор севина концентрацией 5 мг/л активность АХЭ мозга карпа снизилась на 35%, к исходу 1-х суток — на 86%. Гибель рыб па-втупала на 3-й сутки при почти полном угнетении АХЭ (остаточная активность 8%).

В хронических опытах, длившихся 21 сут, снижение активности АХЭ под влиянием растворов севина концентрацией 0,01, 0,1 и 0,5 мг/л продолжалось в течение всего периода наблюдений, н к концу их она составляла 51, 32 и 22% соответственно. Судя по ингибирующему действию на АХЭ мозга, другой карбаматный пестицид

— темик — оказался еще более токсичным, чем севин. Погружение рыб в растворы пестицида концентрацией 0,1, 0,25 и 0,5 мг/л привело через 2 ч к снижению активности АХЭ на 57, 65 и 78% соответственно. Гибель рыб в растворах концентрацией 0,1 мг/л произошла на 3-й сутки, а в растворе концентрацией 0,25 мг/л — на 6-е сутки при остаточной активности АХЭ мозга, равной 5 и 4% соответственно. В хронических опытах с минимальной концентрацией темика 0,001 мг/л к 21-му дню наблюдений активность АХЭ мозга составляла 40% контроля. Из

этих данных следует, что карбаматные пестициды вызывают не менее выраженное и такое же скоротечное угнетение активности АХЭ мозга рыб, что и фосфорорганические пестициды.

Эти материалы показывают, что угнетение активности АХЭ мозга и крови рыб может быть вызвано не только фосфороргаиичеокими пестицидами, но и многими другими токсикантами (фенолы, аммоний; карбаматные и хлорорганические пестициды, синезеленые водоросли и их токсины). Следовательно, использовать этот биохимический показатель для оценки степени загрязнения водных экосистем фоефорорганичеоким'и пестицидами, т. е. для биоиидикации, можно лишь с большой осторожностью наряду с определением остаточных количеств этих пестицидов в рыбах [761, 493], исключив при этом наличие других токсикантов в воде и гидробионтах. Однако сделать это чрезвычайно трудно. Вместе с тем активность ацетилхолинэстеразы — фермента, характеризующего функциональное состояние нервной системы, может служить весьма чувствительным биохимическим индикатором токсичности различных групп веществ, обладающих нервно-паралитическим действием, и имеет прогностическое значение.

Аденозинтрифосфатазы

Среди полифосфатаз — ферментов, гидролизующих фосфорангидридные связи, особое место занимает аденозитрифосфатаза (АТФ-аза), осуществляющая ферментативный гидролиз важнейшего макроэргического соединения аденозинтрифосфата (АТФ), играющего главную роль в энергетическом режиме клетки. Значение ферментативного гидролиза АТФ для энергетического обеспечения различных биохимических процессов стало известно 40 лет назад [666], и с тех пор интерес исследователей к этому процессу нарастает. В начале 70-х годов АТФ-аза стала привлекать внимание токсикологов. Появились сообщения о том, что ведущим механизмом нейротоксического эффекта некоторых хлорорганических пестицидов, в частности ДДТ, следует считать снижение активности Na+, К+ и Mg++, активируемых АТФ-аз нервного волокна [642, 695, 621]. Поскольку АТФаза играет важную роль в обеспечении проницаемости биологических мембран для различных ионов, становятся понятными выявленные ранее изменения в соотношении ионов натрия и калия в нервном волокне, вызванные нарушением проницаемости клеточных оболочек для этих ионов под влиянием ДДТ. Напомним, что ионы натрия и калия имеют исключительно важное значение для регуляции обменных процессов в клетке. Изучение характера действия ДДТ и других пестицидов на активность АТФ-аз различных тканей рыб началось [643, 513, 506, 507, 658, 621, 622] практически одновременно с аналогичными исследованиями на теплокровных животных. В этих исходных исследованиях обнаружено ингибирующее действие хлорорганических пестицидав на АТФ-азы рыб, подобное имеющему место у теплокровных животных.

В серии работ [643, 513, 506, 507] продемонстрировано снижение активности Na+, К+, активируемых АТФаз, а также Mg++ активируемой АТФ-азы мозга рыб под влиянием хлорорганических пестицидов (ДДТ, токсафен, дикофол, эндосульфан). Эти данные, полученные in vitro, были впоследствии подтверждены и расширены за счет использования новых видов рыб и новых пестицидов хлорорганического ряда; длительный (266 сут) контакт подопытных рыб (Pimaphales promeles) с ДДТ концентрацией 2 мкг/л привел к снижению активности митохондриалыюй Mg+-АТФ-азы мозга на 50% в сравнении с нормальной активностью. В то же время отмечено увеличение активности нечувствительной к олигомицину АТФ-азы на 40 % и Na+K+ АТФ-аз на 28 % в сравнении с их активностью у контрольных особей [521, 508]. Активация Mg++ активируемой АТФ-азы митохондрий мозга форели отмечена в опытах с малыми концентрациями ДДТ, однако более высокие его концентрации в большей степени снижают активность нечувствительной к олигомицину Mg++-АТФ-азы в сравнении с чувствительной [618, 619].

Угнетение активности Na+, К+ и Mg++ активируемых АТФ-аз микросомальных фракций мозга под влиянием ДДТ отмечено еще у одного вида рыб (Ictalurus punctatus) [520]. Помимо уже указанных хлорорганических пестицидов (ДДТ, токсафен, дикофол, эндосульфан) ингибирующим действием на зависимые АТФ-азы мозга рыб обладают также кспон, дильдрин и альдрин [864, 521].

Согласно современным представлениям АТФ-азы имеют важное значение для ионной и осмотической регуляции, играя роль своеобразного натриевого насоса у пресноводных рыб [745, 386]. Напомним, что основным элементом осморегуляции пресноводных рыб является активный транспорт натрия и хлора через жабры из воды во внутреннюю среду [61. 246, 492].

Ведущую роль в этом процессе играет проницаемость жаберного эпителия для воды и солей, которая собственно и регулируется локализованными в жабрах Na+, К+ и Mg++ активируемыми АТФ-азами. Уровень активности этих ферментов в жабрах, а также в почках у рыб определяет интенсивность и направленность транспорта ионов и воды [544]. В связи с этим закономерен интерес ихтиотоксикологов к изучению влияния токсикантов на активность АТФ-аз, локализованных в жабрах и почках. Уже в первых работах, выполненных на различных видах морских рыб [621, 622, 710], и радужной форели [513, 658], продемонстрировано угнетающее действие ряда хлорорганических пестицидов на активность АТФ-аз жабр, почек, а также тонкого кишечника. Так, снижение активности Na+, К+ активируемых АТФ-аз жабр и почек радужной форели происходит под влиянием ДДТ, эндосульфана и дикофола [513]. Интересные данные получены в опытах с ДДТ на радужной форели, адаптированной предварительно к морской и пресной воде [658]. У рыб, адаптированных к морской воде, угнетение Na+, К+ активируемых АТФ-аз, вызванное ДДТ, сопровождается нарушением осморегуляции, вследствие чего в крови увеличивается содержание ионов натрия. У форели, адаптированной к пресной воде, снижение активности ферментов менее выражено, а нарушения осморегуляции не происходит. Однако у

пресноводного карася (Carassius auralus) длительное воздействие ДДТ приводило к снижению концентрации ионов натрия и общей осмолярности крови [840].

Торможение активности Na+, К+ активируемых АТФ-аз в жабрах, почках и кишечнике под влиянием ДДТ отмечено и в опытах с другими видами рыб: Pseudopleuronectes-americanus [621], Anguilla rostrata [622], Fundulus heteroclitus [711], Pimephales promelas [521].

Угнетение активности Na+, К+-АТФ-азы и нарушение осморегуляции у морской карпозубой рыбы (Fundulus heteroclitus) и пнмефала (Pimephales promeles) вызывают также полихлорированные бифеннлы [710, 643].

Обобщая имеющиеся экспериментальные данные, можно сделать вывод, что многие хлорорганические пестициды вызывают четко выраженное торможение активности Na+, К+ и Mg++ активируемых АТФ-аз мозга, жабр, почек у морских, пресноводных и проходных рыб. Это дает основание считать, что уровень активности АТФ-аз может служить важным биохимическим показателем токсического действия хлорорганических соединений. Не исключено, что и другие токсические вещества оказывают ингибирующее действие на АТФ-азы рыб, но это не может служить препятствием для их практического использования в ихтиотоксикологических исследованиях.

Тиаминаза (тиамингидролаза)

Это фермент, играющий.важную роль в обеспечении нормального хода обменных процессов с участием витамина B1 (тиамина). Тиаминаза расщепляет тиамин на тиазоловый и пиримидииовый компоненты, лишенные биологической активности, т. с. является естественным регулятором действия тиамина. Увеличение активности тиаминазы в различных тканях приводит к снижению количества тиамина и нарушению нормального хода биохимических процессов, характерных для B1-авитаминоза. В течение минувшего десятилетия киевскими ихтиотоксикологами [206, 208, 15, 16] получены оригинальные данные об изменении активности тиаминазы и содержании общего тиамина в тканях рыб, подвергнутых токсическому действию синезеленых водорослей.

Многократно воспроизведенными опытами на разных видах рыб (окунь, судак, язь, плотва, лещ, толстолобик, красноперка) показано, что под действием метаболитов и продуктов распада синезеленых

.водорослей возрастает активность тиаминазы, снижается содержание тиамина, что приводит к развитию специфического Bi-авитаминоза с характерным для него симптомом паралича и последующей скоротечной гибелью. Выраженность изменений системы тиаминаза — тиамин, а также время появления признаков паралича и гибели рыб определяются количеством внесенных в аквариумы синезеленых водорослей и видовыми особенностями токсикореэистентности рыб.

Так, например, в опытах на 2-летнсм толстолобике установлено, что увеличение концентрации синезеленых водорослей с 0,8 до 6 г/л сокращало время выживания подопытных рыб, содержащихся в аквариумах с постоянной аэрйцией воды, с 19 до 1,5 ч [206]. По данным О. М. Арсана [15], к моменту появления первых признаков паралича у рыб, отравленных синезелепыми водорослями, активность тиаминазы в печени окуня увеличивалась на 33-38%, судака — на 39-40%, язя — на 22-34% в сравнении с ее активностью в печени контрольных рыб. Одновременно с этим происходит снижение содержания тиамина в печени окуня на 23-25%, судака на 54-60%. язя на 42-54%. Дальнейшее развитие токсического процесса, завершающееся гибелью подопытных рыб, сопровождается еще более глубоким снижением содержания тиамина в печени (у окуня более чем на 50%, у судака на 74%, у язя на 60-65%). Интересно, что активность тиаминазы печени в момент гибели у окуня несколько возрастала (43-59%) по сравнению с ее активностью у парализованных рыб, у судака осталась практически без изменений (54%), а у язя даже несколько снизилась (30-36%). Иными словами, снижение содержания общего тиамина непропорционально увеличению активности тиаминазы [206]. Сходные по направленности и примерно одинаковые по выраженности изменения системы тпамнназа-тиамнн происходят и в кишечнике рыб, отравленных нативными водорослями.

Исследованиями А. Я. Маляревской [206] показано, что токсины, выделенные из Microcystis aeruginosa, оказывают более выраженное активирующее действие на тиаминазу органов и тканей рыб, чем нативные водоросли. Кроме того, повышение активности тиаминазы и снижение содержания тиамина отмечены у рыб, отравленных ДДТ, хлорофосом и при дефиците кислорода. Следует отмстить при этом, что гипоксия и ДДТ вызывали фазовые изменения активности тиаминазы и снижение уровня тиамина у рыб. Первоначальная фаза повышенной двигательной активности у рыб сопровождалась снижением активности тиаминазы и увеличением содержания тиамина в печени и кишечнике рыб (толстолобик, карп, судак, карась). Следующая за этим вторая фаза — фаза адинамии (начальная стадия паралича) — приводила к противоположным по направленности изменениям системы тиаминаза — тиамин, т. е. к увеличению активности фермента и снижению содержания витамина. Анализируя результаты многолетних исследований, А. Я. Маляревская 1206] приходит к выводу, что «появилась возможность на основании определения величины этих двух показателей судить об интоксикации рыб под влиянием метаболитов синезеленых водорослей и оценить уровень накопления их токсинов в организме рыб, безопасный для потребления последних человеком и животными» (с. 79).

Краткий обзор накопленных к настоящему времени данных по влиянию токсикантов на активность ферментов свидетельствует о перспективности этого направления исследований современной ихтиотоксикологии. Большинство данных получено на тканевых ферментах (за исключением сывороточной холинэстеразы). Ферменты сыворотки крови остаются все еще вне поля зрения их-тиотоксикологов. Между тем их количество у человека, например, варьирует, по данным разных авторов, от 50 до 100. Основная масса

ферментов крови образуется клетками тканей и поступает в кровь в результате распада и последующего освобождения ферментов. В связи с этим возникла идея использовать ферменты, образующиеся в тканях и циркулирующие в крови, для диагностических целей. Ведь в основе любого патологического процесса лежат нарушения координированной деятельности ферментных систем. Успехи клинической биохимии позволили всесторонне обосновать представление об определенных биохимических синдромах, характеризующих тот или иной патологический процесс. Особое место при этом заняла энзимодиагностика, т. е. оценка уровня активности отдельных ферментов сыворотки крови в диагностических целях. К настоящему времени установлены три типа изменений ферментного спектра крови. Изменения первого типа заключаются в понижении активности постоянно присутствующих в крови ферментов (гипофермснтемии). Они отражают гипофункцию пораженных органов. Изменения второго типа выражаются в повышении содержания или активности этих же ферментов (гииерферментемии). Они могут быть обусловлены либо повышением функции органа, либо нарушением нормального режима выделения ферментов из-за патологической проницаемости. Наконец, изменения ферментного спектра третьего типа заключаются в появлении в крови ферментов, которые'в нормальных условиях отсутствуют. Нетрудно видеть, что изменения первого и второго типов определяются на основе количественных показателей активности ферментов, а изменения третьего типа характеризуют качественные изменения ферментного спектра и представляют особый интерес. Перечисленные нарушения во многих случаях носят специфический характер. Их выявление служит решающим подтверждением клинического диагноза, а изучение в динамике — ценным прогностическим тестом. Чаще других в клинической биохимии используют щелочные и кислую фосфатазы, трансаминазы, альдолазу, амилазу, холинэстеразы. Некоторые из этих ферментов сыворотки крови стали успешно применяться в токсикологических исследованиях. Не приходится сомневаться в том, что энзимодиагностика займет в ихтиотоксикологии столь же почетное место, которое по праву принадлежит ей в клинической биохимии.

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ТРАНСФОРМАЦИИ ТОКСИКАНТОВ

Р. Т. Уильямс в предисловии к монографии Д. Парка [263] писал: «Теперь мы знаем, что организм обладает защитным биохимическим механизмом, который предохраняет нас от пагубного воздействия этих (чужеродных) веществ, но мы должны знать, как эта защитная система работает и каковы ее возможности» (с. 6). Разработка этих вопросов ведется сегодня биохимиками и токсикологами как у нас в стране, так и за рубежом. Установлено, что чужеродные соединения (ксенобиотики), поступающие в организм млекопитающих, претерпевают сложные изменения, протекающие обычно в два этапа.

На первом из них происходят различного рода метаболические превращения (окисление, восстановление, гидролиз, дегидрохлорирование, десульфироваиие и др.), ведущие к появлению в молекуле ксенобиотика новых функциональных групп, повышающих ее полярность. В результате токсичность вещества может быть либо ослаблена (детоксикация), либо усилена.

Биотрансформания чужеродных соединений катализируется ферментами, локализованными в микросомальной фракции клеток печени и других тканей. У теплокровных животных это — система смешанных оксидаз. Они осуществляют превращения разных по строению органических соединений при участии НАДФ•Н2 (восстановленный никотинамидадениннуклеотидфосфат) и молекулярного кислорода [263]. Активированный НАДФ•Н2 кислород в присутствии различных микросомальных лидрокеилаз окисляет ядовитое соединение, изменяя его токсические свойства в сторону ослабления или усиления. Многие фосфорорганичеокие соединения, например, подвергаются в организме биологической активации (летальный синтез или токсификация) в результате окислительной десульфурации, т. е. отщепления серы и замены ее кислородом.

Исследованиями последнего десятилетия [471, 505, 572, 661, 679, 600, 446, 737, 738, 501, 736, 620] доказано, что рыбы имеют все ферменты, необходимые для метаболизма липидорастворимых чужеродных веществ, а реакции, катализируемые этими энзимами, аналогичны таким реакциям у млекопитающих. Приведем некоторые примеры.

Известное для млекопитающих окислительное десульфирование фосфорорганичеоких пестицидов, в частности превращение паратириа в более токсичный параоксон и окисление фосфотионатовых инсектицидов в более токсичные фосфаты, происходит также в печени рыб [749а, 446]. Микросомальные ферменты печени рыб катализируют различные реакции окисления, а также обладают азо- и нитроредуктаздой активностью [409а, 4096]. Микроеомальная гидроксилирующая система печени рыб подобно аналогичной системе млекопитающих включает в себя окоидазы смешанного действия НАДФ•На и цитохром Р-450, представляющий собой кислородактивирующий компонент микросомальных оксидаз [600]. На примере диазинона (базудин) показано его превращение в печени сома с помощью окислительной десульфурации в диазоксон с последующим расщеплением с диазинона и диазоксона до диэтилтиофос-форной и диэтилфосфорной кислот.

Помимо фоефорорганических пестицидов микросомальные ферменты печени рыб катализируют метаболические превращения других ядовитых соединений, в частности различных нефтепродуктов и полициклических ароматических углеводородов, в том числе нафталина 3,4-бензапирена [661, 737, 501].

Акцентируя внимание на принципиальном сходстве ферментных систем, осуществляющих метаболические превращения ксенобиотиков у рыб и млекопитающих, мы должны иметь в виду, что метаболизм чужеродных соединений в организме рыб происходит медленнее [620], чем у млекопитающих. По мнению Д. Парка [263], «количественные различия в метаболизме чужеродных соединений зависят от скоростей реакций

альтернативных метаболических путей» (с. 162) и определяются в первую очередь различной относительной активностью детоксицирующих ферментов, различной концентрацией) коферментов и косубстратов.. На примере гидроксилазы углеводородов показано, что микросомальная ферментная система печени у радужной форели в 26 раз активнее, чем у крысы [737]. Однако такие данные пока единичны, и, как правило, активность микросомальных ферментов у рыб заметно ниже, чем у млекопитающих [471, 510, 504]. Так, активность бифенилгидрокеилазы у форели, равная 0,2 мкмоль продукта на 1 г печени в час, в 30 раз ниже, чем у нутрии, в 10 раз ниже, чем у кролика, в 8 раз ниже, чем у кур, и в 5,5 раза ниже, чем у лягушки [504].

Новейшими исследованиями продемонстрировано еще одно принципиальное сходство между рыбами и млекопитающими в их реакции на токсические вещества. Оказывается, ксенобиотики, поступая в организм рыб, способны индуцировать у них образование ферментов, катализирующих метаболические превращения чужеродных соединений. Например, активность гидрокеилаз, метаболизирующих растворенные нефтепродукты и некоторые полициклические ароматические углеводороды, заметно возрастает в тканях рыб (печень, жабры, почки), подвергшихся токсическому воздействию этих веществ как в экспериментальных, так ив естественных условиях [737, 738, 501, 736].

Продукты метаболических превращений, катализируемые микросомальными ферментами печени, могут затем выделяться без каких-либо изменений, вступать в синтетические реакции конъюгации, подвергаться метаболизму с помощью нормальных процессов межуточного обмена и, наконец, аккумулироваться в тканях [263]. Реакцию конъюгации справедливо рассматривают как истинную детоксикацию различных ядов. Это второй этап метаболических превращений многих ксенобиотиков, обладающих токсическими свойствами. «Конъюгация представляет собой биосинтез, при котором чужеродные соединения или их метаболиты соединяются с легкодоступными субстратами (например, глюкуроновая кислота, сульфат, ацетил, метил, глицин), образуя конъюгаты. Конъюгация происходит путем присоединения к функциональной группе чужеродного соединения (например, гидроксильной, аминной, карбоксильной, эпоксидной или атому галогена), и обычно, в результате этого молекула становится более полярной, менее липидорастворимой и поэтому более легко выделяемой из организма животного» [263, с. 92]. Каи и метаболические превращения, реакции синтеза и конъюгации протекают при участии специфических ферментов.

Важнейшим механизмом детоксикации многих чужеродных веществ у млекопитающих и других животных считают глюкуроновую конъюгацию, т. е. соединение ксенобиотика с глюкуроновой кислотой, источником которой являются активированная при участии АТФ глюкоза или ее предшественники.

Специфическим коферментом служит уридинфосфат (УДФ).

В литературе нет единого мнения относительно наличия у рыб этого важнейшего механизма детоксикации глюкуроновой конъюгации. Одни авторы считают [429, 610], что у рыб образуются глюкуронидные конъюгаты. Об атом свидетельствует наличие в гомогенатах печени рыб β-глюкуронидазы и пирофосфатазы УДФглюкуроновой кислоты, а также продуктов конъюгации билирубина и аминобензойной кислоты с глюкуроновой кислотой. По мнению других исследователей [263], хотя рыбы и обладают необходимыми ферментами, у них не образуются глюкуронидные конъюгаты из-за недостатка кофермента уридинфосфатглюкуроновой кислоты и неспособности синтезировать УДФ-глюкуроновую кислоту. При этом не учитываются имеющиеся в литературе сведения о «аличии, по крайней мере, у некоторых видов рыб (форель, треска) УДФ-глюкуроновой кислоты. Возможно, расхождения по этому вопросу определяются видовыми особенностями исследованных рыб, и здесь необходимы дальнейшие исследования на экологически различных группах рыб.

В печени рыб протекают и другие реакции конъюгации: ацетилирование, метилирование, образование тиоцианатов, а также пептидные конъюгации [263]. Изучение биохимических механизмов детоксикации и токсификации различных соединений в организме рыб, по существу, только начинается.

Дальнейшая разработка этого раздела токсикологической биохимии рыб позволит понять глубинные механизмы, определяющие видовые и возрастные особенности токсикорезистентности разных по высоте организации и экологии групп рыб.

ГЛАВА VI

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИХТИОТОКСИКОЛОГИИ

В октябре 1961 г. нами была представлена ученому совету Института биологии водохранилищ АН СССР

долгосрочная программа разработки физиологического аспекта проблемы влияния токсикантов на рыб. В результате анализа имевшихся к тому времени экспериментальных данных мы пришли к выводу о необходимости перехода от опытов с констатацией выживаемости животных к опытам с использованием более чувствительных физиологичеоких показателей действия ядов на рыб, выявить которые можно задолго до наступления у них признаков необратимого отравления и гибели. Мы считали, что только истинно физиологический подход с использованием новейших методик позволит научно обоснованно, а главное, в кратчайшие сроки получить объективную информацию о механизмах действия токсикантов, величине пороговой и предельно допустимой концентрации различных веществ. Мы обращали внимание также на необходимость параллельного изучения различных физиологических функций организма в условиях действия яда на рыб. Сравнительное изучение степени чувствительности разных функций к токсическим агентам позволит выявить слабое функциональное звено и комплекс сдвигов, вызываемых ядами, и по этому слабому звену (фуикция-мишень) можно будет

обоснованно судить о ПДК яда для организма в целом. В качестве наиболее существенных и тонких физиологических показателей степени токсичности вещества могут служить количественные и качественные сдвиги в осуществлении таких физиологических функций, как поведение (условнорефлекторная деятельность), дыхание, кровообращение, иммунитет, а также изменения со стороны системы крови и других функциональных систем.

Количественные и качественные сдвиги и изменения в актограмме, пневмограмме и кардиограмме позволяют детально и объективно описать все симптомы, предшествующие или сопутствующие гибели рыб от токсикантов, а также выявить специфику, если она имеется, обусловленную химической природой действующего токсиканта [161-163].

Экспериментальная разработка предложенной нами программы началась с изучения механизмов токсического действия ядов органического ряда, поскольку без понимания путей и способов влияния различных групп токсикантов на организм невозможен правильный выбор конкретного метода определения пороговой и предельно допустимой концентраций, т. с. решение центральной' задачи ихтиотоксикологии.

РОЛЬ ЦЕНТРАЛЬНОЙ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ В РЕАКЦИИ РЫБ НА ТОКСИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА ОРГАНИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

Многие токсические вещества, поступающие в рыбо-хозяйственные водоемы (фенолы, смолы и дегти, алкалоиды, сапонины и терпены, продукты выщелачивания древесины, хлорорганические и фосфорорганические пестициды, производные карбаминовой кислоты, некоторые гербициды и альгициды, а также ряд неорганических веществ), обладают так называемым нервно-паралитическим действием [149], т. е. оказывают прямое или косвенное влияние на нервную систему теплокровных животных и человека. Типичными представителями ядов органического ряда служат фенол и его производные, которые в силу своего широкого распространения и токсичности для гидробионтов уже давно привлекли внимание ихтиотоксикологов. К началу наших экспериментальных работ (1962-1963 гг.) многие исследователи на основе наблюдений за поведением рыб в токсических растворах фенолов и внешним симптомокомплексом фенолыюго отравления высказывали предположения о том, что соединения этого ряда оказывают прямое влияние на нервную систему рыб. Однако прямых экспериментальных доказательств участия центральной нервной системы в реакциях рыб на фенольное раздражение представлено не было. Учитывая это обстоятельство, в начале 60-х годов мы провели серию экспериментов по выявлению роли центральной нервной системы в развитии внешнего симптомокомплекса отравления рыб ядами органического ряда на модели феиольной интоксикации карасей (Carassius carassius) [158, 165, 166, 170].

В первой серии опытов было предпринято изучение возможности торможения (блокирования) реакции рыб на фенольное раздражение посредством использования препаратов, угнетающих центральную нервную систему (наркоз): уретана (центрально действующий) и новокаина — препарата из группы анестетиков, который, по данным наших опытов, проникая в общий круг кровообращения, вызывает типичный наркотический эффект (159). Использовали 0,5, 1 и 2%-ный растворы уретана и 0,25, 0,5 и 1%-ный растворы новокаина. Глубину наркоза подопытных рыб регулировали путем изменения концентрации препарата или времени экспозиции (от 2,5 до 20 мин). Наркотизированных карасей помешали в растворы фенола концентрацией 50, 100, 400 и 800 мг/л, чаше — в раствори концентрацией 100 и 400 мг/л. Влияние общего торможения центральной нервной системы на развитие фенольной интоксикации определяли, с помощью следующих показателей: латентный период первой фазы фенольного отравления (бурная двигательная активность), характер и выраженность внешнего симптомокомплекса фенолыюго отравления, интенсивность и структура двигательной активности (актограмма), время и процент гибели испытуемых рыб, степень обратимости фенольной интоксикации. Двигательную активность регистрировали с помощью счетчика импульсов АТС и кимографической записи двигательных импульсов.

Предварительными опытами установлено, что наркотический эффект новокаина как но скорости наступления, так и по длительности действия значительно превосходит наркотический эффект уретана. Оптимальный наркотический эффект развивался при помещении рыб на 10 мин в 1%-ный раствор новокаина и 2%-ный раствор уретана.

Согласно полученным данным (табл. 17) у карасей, наркотизированных уреганом и подвергнутых токсическому воздействию фенола концентрацией 100 мг/л, резко увеличивается латентный период первичной реакции на фенольное раздражение, т. е. наркоз предупреждает и временно снимает все внешние проявления фенольной интоксикации рыб. Выраженность купирующего действия уретана находится в прямой зависимости от глубины обусловленного им наркоза, который в свою очередь при неизменной концентрации наркотика определяется временем нахождения рыб в растворе уретана. Так, наркотический эффект, полученный при 2,5- минутной экспозиции, увеличивает латентный период развития фенольной интоксикации в 8 раз по сравнению с латентным периодом у контрольных особей, а при 15-минутной экспозиции — в 40 раз.

Таблица 17

Латентный период реакции и двигательная активность наркотизированных уретаном карасей в растворе фенола

Интенсивность двигательной активности наркотизированных карасей, погруженных в токсический раствор фенола, не претерпевает существенных изменений, если сравнивать средние величины двигательной активности, представленной количеством импульсов (см. табл. 17). Однако динамика двигательной активности, ее распределение во времени у подопытных рыб заметно отличаются от этих показателей у контрольных интактных особей (рис. 17 и 18).

Рис. 17. Динамика двигательной активности карасей, наркотизированных уретаном под влиянием фенола (100 мг/л).

По оси абсцисс дано время (в мин), по оси ординат — количество импульсов: 1,2,3 — номера карасей; А — контрольные особи;

В— караси, наркотизированные 2%-ным раствором уретана в течение 5 мин;

В— караси, наркотизированные 2%-ным раствором уретана в течение 10 мин

Рис. 18. Зависимость между выраженностью двигательной активности карасей в растворе фенола (100 мг/л) и глубиной уретанового наркоза.

1, 2, 3, 4, 5 — номера карасей. Сверху вниз—двигательная активность контрольных карасей и наркотизированных в течение 2,5; 5 и 10 мин.

Стрелкой указан момент погружения карасей в раствор фенола.

У подопытных карасей продолжительность интенсивной двигательной активности в среднем в 2 раза больше, чем у контрольных, что выражается в различной форме актограмм (см. рис. 18). Тем не менее различия в суммарной двигательной активности рыб обеих групп при этом статистически недостоверны (рассчитано но нспа-ра'метрическому критерию Вилкоксона).

Увеличение концентрации фенола в 4 раза (от 100 до 400 мг/л) не оказало существенного влияния на основной феномен — предупреждение и временное блокирование уретаном фенольного отравления, однако выраженный тормозной эффект обнаружен только у рыб, подвергавшихся наркозу в течение 10 и 15 мни.

Для выявления влияния наркоза на время и процент гибели рыб в остротоксичных растворах фенола (l00, 200, 400 и 800 мг/л) проведена серия опытов на 80 карасях. Установлено, что уретановый наркоз (15-минутная экспозиция в 2%-ном растворе) не оказывает существенного влияния на продолжительность жизни испытуемых карасей. Отчасти подобный исход опытов можно объяснить недостаточной глубиной наркоза. Для проверки этого предположения было проведено несколько серий опытов с новокаином.

В первой из них удалось установить, что новокаиновый наркоз предупреждает и временно снимает возбуждающее действие фенола на рыб, о чем свидетельствуют данные табл. 18.

Таблица 18

Латентный период реакции и двигательная активность наркотизированных новокаином карсей в растворе фенола (100 мг/л)

Как и в опытах с уретаном, выраженность тормозного влияния новокаина на внешний симптомокомплекс фенолыюй интоксикации рыб определяется глубиной наркотического эффекта, зависящей от продолжительности наркотизации. При увеличении глубины наркоза (экспозиция 5 и 10 мин) отмечаются ярко выраженное торможение всех внешних проявлений фенолыюй интоксикации и значительная задержка латентного периода первой фазы двигательного возбуждения рыб. Практически она 'так и не наступала у подопытных карасей (при 10-минутной наркотизации), о чем можно судить ио динамике двигательной активности у подопытных и контрольных рыб (рис. 19). Если у контрольных особей интенсивное двигательное возбуждение развивается на протяжении 2-4 мин, а общая продолжительность двигательной активности равна 12-14 мин (рис 19, А), то у подопытных (рис. 19, Б) двигательная активность появлялась на 30-70-й минуте после погружения в раствор