4 курс / Общая токсикология (доп.) / Obschaya_ikhtiotoxikologia_Lukyanenko

компенсаторными механизмами, обеспечивающими постоянство внутренней среды. Разумеется, чувствительность различных функциональных систем организма к токсическому воздействию неодинакова при различных ядах, и нарушение деятельности одних наступает позже, чем других.

Так, временное обратимое угнетение, например центральной нервной системы мирных рыб, может оказать влияние на их ориентацию, способность к обнаружению и избеганию ядов или взаимоотношения с хищными видами рыб, что приведет к их гибели. Иными словами, нарушение других жизненно важных физиологических процессов может оказать губительное действие на организм задолго до того периода, когда можно будет судить о плодовитости и качестве потомства.

Эти вполне очевидные положения [163] нашли подтверждение в серии экспериментов, выполненных на модели фенолыюй интоксикации гуппи [363]. Согласно полученным данным нарушение приобретенных (условные реакции) и врожденных (сексуальное поведение) рефлексов наступает задолго до нарушения способности к репродукции, которое в свою очередь предшествует гибели подопытных рыб.

Полученные в последние полтора десятилетия многочисленные экспериментальные данные однозначно подтверждают выдвинутое нами [163] представление о том, что ПДК вещества не должна оказывать токсического эффекта ни на одну из многочисленных функций организма, т. е. не должна вызывать патологических сдвигов в любой отдельно взятой функциональной системе организма, ибо нарушение любой из них может привести к нарушению физиологической нормы организма и его биологического благополучия.

ВРЕМЯ ДЕЙСТВИЯ ЯДА

Фактор времени наряду с концентрацией яда играет решающую роль в определении степени токсичности исследуемого вещества. Время является одним из составных элементов отношения концентрация — время, на котором базируется вся математическая функция, объясняющая токсический процесс. Известно, что при одной и той же концентрации токсиканта выраженность и исход токсического процесса меняются в зависимости от времени действия яда на организм. Следовательно, продолжительность наблюдений может оказать и оказывает решающее влияние на оценку степени токсичности того или иного вещества. При ближайшем рассмотрении обнаруживается, что фактор времени имеет неодинаковое содержание. В случае необходимости определения летальной или пороговой концентрации экспозиция (время контакта рыбы с ядом) продолжается до появления интересующего нас признака (смерть или другая патологическая реакция). Здесь регистрируемый эффект развивается в период экспозиции, и время контакта рыбы с ядом частично или полностью входит во время развития реакции. Однако это происходит не всегда, и нередко регистрируемый эффект развивается не во время экспозиции, а значительно позже. В последнем случае между экспозицией и наступлением токсического эффекта имеется значительный промежуток времени, иногда превышающий продолжительность экспозиции в десятки и сотни раз. Это имеет особое значение при анализе причин неожиданной массовой гибели рыб в районах, удаленных от мест сброса промышленных стоков.

Фактор времени играет большую роль при определении пороговых концентраций ПДК токсического агента. Именно в этом случае первостепенное значение имеет продолжительность опытов, в зависимости от которой результаты исследования токсичности вещества могут быть положительными или отрицательными.

Абсолютное большинство исследователей ограничивали и ограничивают продолжительность своих наблюдений несколькими часами, в лучшем случае — 1-2 сут. [778, 542, 791, 469]. При изучении острого и сверхострого отравления рыб, т. е. отравления высокими концентрациями яда, этого времени опыта обычно вполне достаточно для получения экспериментальной модели той или иной интоксикации и решения вопроса о самом факте токсичности данного компонента промышленных сточных вод и возможности его сброса в водоем без предварительной нейтрализации или снижения концентрации. Значение таких опытов вполне определенно, тем более что, по мнению П. Вивье [830], следует строго различать кратковременные (1-2 ч) и более длительные (несколько часов, суток, недель и т. д.) загрязнения. В первом случае, как и в лабораторных исследованиях, имеет место кратковременный контакт рыб с ядом.

Другое дело, когда речь идет об изучении вещества малой токсичности или выявлении токсического эффекта малых концентраций яда. В этом случае продолжительность наблюдений приобретает первостепенное значение. Практические рекомендации по биологическому нормированию ПДК токсического вещества в этом случае могут быть даны лишь с учётом данных хронического эксперимента.

В ранних опытах Н. С. Строганова и А. Т. Пажиткова [337] показано, что при использовании в качестве критерия токсичности меди гибель испытуемых рыб, время контакта их с ядом играет ведущую роль в определении его летальной концентрации. Так, увеличение продолжительности наблюдения до 2 мес. выявляло летальное действие меди на карасей уже при ее концентрации 1 мг/л. Однако если бы авторы ограничили длительность опытов 8 сут, то пороговая летальная концентрация меди оказалась бы в 6 раз выше (6 мг/л). Аналогичные результаты были получены авторами и в опытах на уклейке с углекислым аммонием. Наблюдения, проводившиеся в течение 24 ч, выявили летальную концентрацию 50 мг/л по азоту (углекислый аммоний). Увеличение времени контакта рыб с ядом до 15 сут приводило к их гибели при концентрации яда, в 2 раза меньшей (24 мг/л).

Универсальность этого правила (зависимость пороговой летальной концентрации яда от времени контакта рыб с ним) подтверждена при испытании токсичности химических соединений других классов, в частности фенолов [37а, 187, 188].

М. Ф. Вернидуб [37а] в опытах на личинках лосося убедительно показала, что в зависимости от продолжительности опыта существенно меняется и пороговая летальная концентрация: концентрация нелетучих фенолов 50 мг/л вызывает гибель рыб за 4 сут, а концентрация 3 мг/л — за 18-20 сут.

В наших опытах, выполненных на сеголетках (140 особей) и взрослых карасях в сходных методических условиях (температура 13-15° С, содержание кислорода в воде 5-6,5 мг/л, рН 7,3-7,6 и жесткость воды 9,2-10,6° Н), также выявлено решающее значение фактора времени в проявлении летального эффекта малых концентраций фенола. За 96 ч наблюдений концентрация фенола 25 мг/л приводила к развитию у рыб лишь ряда симптомов фенольной интоксикации без летального исхода. Увеличение продолжительности опытов до 10 сут само по себе без изменения концентрации яда вызывало 100%-ную гибель испытуемых рыб. Анализ хода кривых, представленных на рис. 7 и 8 (25 и 50 мг/л фенола), показывает, что по мере увеличения времени контакта рыб с ядом нарастает сила летального эффекта, что проявляется в постепенном увеличении процента гибели испытуемых рыб. Естественно, первыми гибнут наименее устойчивые особи, но их смертность, нарастающая по мере увеличения контакта рыб с ядом, соответствует в известной мере нарастанию токсического процесса у более выносливых рыб и может иметь прогностическое значение для выборочной совокупности в целом.

Рис. 7 Динамика гибели карасей в растворе фенола (25 мг/л)

Рис. 8. Динамика гибели карасей в растворе фенола (50 мг/л)

Серия работ, выполненных в последние годы с инсектицидами, показала также, что с увеличением времени испытания изменяются представления о степени токсичности этой группы соединений.

У. Матсуэ, Т. Эндо и К. Табата [693] в экспериментах с паратионом на золотых рыбках установили, что с продлением опытов до 30 сут паратион оказывает токсическое действие в концентрации, в 30 раз более низкой, чем при 48-часовом воздействии летальной концентрации (CL50). На основе полученных данных авторы высказывают сомнение относительно возможности рекомендовать в качестве допустимой для водоемов концентрацию паратиона 0,1 CL50, которую в США часто принимают за безвредную.

Испытание токсичности некоторых гербицидов, в частности 2, 4, 5-трихлорфеноксиуксусной кислоты, 4- хлор-2 метилфенолксиуксусной кислоты и ряда других, показало, что продление экспериментов до 3 нед и более вызывает токсические явления и даже гибель подопытных рыб без существенного изменения концентрации яда [458].

К. Клинглер [641] приводит данные, полученные в опытах с нитритом натрия. Хотя это вещество малотоксично, его концентрация 50 мг/л вызывает гибель гольянов в среднем за 14 сут, при индивидуальном разбросе — от 34 ч до 23 сут.

Привлекает внимание обстоятельное исследование Р. Маркеттн [690], выполненных на карасях, обработанных различными концентрациями аммиака. Опыты проводились в жесткой воде при температуре 1515,5°С, рН 6,8-7,0. Продолжительность наблюдений 110 сут. Большинство подопытных рыб погибли на 30-40-е сутки с начала опыта с характерными изъявлениями, особенно хорошо выраженными на анальном и хвостовом плавниках. Гистологический анализ показал, что это форма типичного некроза. Автор считает, что в данном случае, хотя и не исключено прямое внутреннее действие аммиака на рыб, скорее имеет место действие яда на защитный слой слизи, вырабатываемой железами, вследствие чего возможно более легкое проникновение бактерийных и грибковых возбудителей в организм рыбы.

Данные, полученные в опытах с различными группами химических токсикантов, убедительно свидетельствуют о ведущей роли фактора времени в определении степени токсичности различных групп веществ.

Особое значение длительность опытов приобретает при изучении малотоксичных соединений, вредное действие которых проявляется только после длительного контакта рыб с ними.

В качестве показателя токсичности того или иного соединения и уровня устойчивости рыб к нему часто используют время их выживания в токсическом растворе. Кроме того, в ряде работ применяют и другие критерии токсичности: время погружения, необходимое для начала токсического процесса; время развития токсического процесса до некоторого хорошо заметного уровня (время опрокидывания рыб) и минимальное время экспозиции для наступления токсического процесса (летальное время).

Первый из этих критериев — время погружения — весьма близок по своему содержанию к понятию «латентный период», т. е. промежутку времени между началом контакта рыбы с ядом и первыми признаками у них отравления. Первоначальные признаки отравления и длительность латентного периода интоксикации будут различны в зависимости от природы испытуемого вещества и вида рыб. Так, у большинства видов рыб первыми признаками отравления фенолами являются бурная двигательная активность и неориентированное плавание, а у угря и налима — судорожные подергивания мышц туловища. При испытании токсичности растворов тяжелых металлов в качестве первого признака отравления рыб может быть использовано расстройство дыхания. Вполне понятно, что время погружения или латентный период будут весьма различны по абсолютной величине и определяются главным образом механизмами реализации токсического действия яда. Яды, оказывающие преимущественное действие на центральную нервную систему, имеют короткий латентный период, исчисляемый секундами, а те из них, которые оказывают наружное или локальное воздействие на рыб, имеют более длительный латентный период (минуты, часы и даже сутки).

Критерий «время погружения» весьма ценен с точки зрения оценки латентного периода интоксикации, который может быть использован для характеристики степени чувствительности рыб к яду. Именно поэтому он малополезен в качестве показателя степени устойчивости рыб к яду или степени токсичности испытуемого вещества.

Второй критерий представляет собой время наступления одного из наиболее показательных признаков отравления. Чаще всего в качестве такого признака используют потерю рефлекса равновесия, т. е. время опрокидывания, именуемое также временем проявления (manifestation time). По К. Вурману и X. Вокеру [860J, под временем проявления подразумевается время, в течение которого рыба теряет способность к движению и не может долго удерживать равновесие в проточной воде. Широкое использование этого критерия для оценки токсичности вещества встречает ряд общих и частных затруднений. Прежде всего в случае испытания токсичности веществ, не влияющих на нервную систему рыб (большинство солей тяжелых металлов, щелочи, неорганические кислоты), потеря рефлекса равновесия наступает обычно незадолго до их гибели. Кроме того, при действии на рыб других веществ, например цианидов, в качестве наиболее характерного признака отравления кроме потери рефлекса равновесия могут быть использованы иные, скажем, изменение интенсивности потребления кислорода.

Однако даже при воздействии на рыб ядов, вызывающих потерю рефлекса равновесия, едва ли имеет смысл использование времени проявления в качестве критерия токсичности. Опыты показывают, что при изучении токсичности ядов фенольпого ряда для различных видов рыб в растворах концентрацией от 10 до 50 мг/л (в зависимости от вида) имеет место волнообразное течение интоксикации, при котором периоды потери рефлекса равновесия и полного обездвижения чередуются с кратковременными появлениями у рыб способности к импульсивным перемещениям в боковом положении. Эти наблюдения в первую очередь относятся к резистентным видам рыб, например карасю. Но даже в краткосрочных опытах по острому отравлению [192] малоустойчивых видов рыб (форель, окунь) время проявления весьма вариабельно, что не позволяет с достоверностью судить о степени устойчивости рыб или степени токсичности вещества. Критерий «время проявления», ограничивающий длительность наблюдений несколькими часами, не позволяет уловить качественные и количественные особенности протекания токсического процесса у рыб при изменении концентрации ядов.

Имеются и другие серьезные препятствия для использования этого критерия. Во-первых, нет никаких сведений относительно характера связи между временем проявления и временем гибели рыб. Результаты наших опытов, полученные на большом количестве испытуемых рыб, показывают, что при значительном, иногда десятикратном, увеличении или уменьшении концентрации яда в растворе время проявления претерпевает незначительное изменение, редко превышающее двукратное. При этом соотношение между временем проявления

ивременем гибели испытуемых рыб оказывается различным как при разных концентрациях токсического вещества, так и при разных веществах даже в опытах на одном виде рыб. Во-вторых, при равном времени проявления время гибели рыб весьма заметно колеблется в зависимости от вида. Так, у форели и плотвы, плотвы

икарасей при сходном времени проявления время гибели резко отлично и находится в прямой зависимости от

устойчивости вида.

Несмотря на ограниченные возможности критерия «время проявления», его можно использовать в качестве показателя острой токсичности в тех случаях, когда необходима оперативная информация для однозначного ответа на вопрос о самом факте токсичности сточных. вод сложного состава, поступающих в рыбохозяйственный водоем с конкретного предприятия. Иными словами, этот показатель может быть использован при биотестировании на рыбах.

Третий критерий — летальное время — определяется на основе измерения времени экспозиции, приводящего к развитию полностью или частично необратимого отравления. Этот критерий токсичности имеет

существенное значение в тех случаях, когда перед исследователем стоит необходимость изучения спорадических загрязнений водоема. Вместе с тем токсикологическое содержание критерия «летальное время» не вполне ясно. В цитированной выше статье К. Вурмана и X. Вокера, посвященной изучению токсичности аммония и цианидов, авторы делят период погружения рыбы в токсический раствор до смерти на два этапа: первый этап (латентный) включает период нахождения рыбы в токсическом растворе до того момента, когда она еще способна при перенесении в чистую воду вернуться в нормальное состояние; второй этап (летальный) характеризуется периодом необратимого отравления. Бесспорно, такое деление представляет интерес в плане оценки обратимости токсического процесса, однако оно не позволяет характеризовать качественный состав симптомо-комплекса отравления, фазность его течения и тем более судить о степени резистентности испытуемых рыб. Явно неудачно обозначение первого этапа латентным, так как обратимость токсического процесса возможна при весьма глубоких и явных признаках отравления, которые никак нельзя назвать скрытыми. По-видимому, этот вопрос нуждается в дальнейшей экспериментальной доработке и подборе соответствующей терминологии.

Четвертый критерий — время выживания (survival time) — представляет собой время, необходимое для развития летального отравления. Нам представляется, что время гибели рыб является одним из наиболее полноценных критериев токсичности различных веществ и динамики изменения токсичности в зависимости от концентрации вещества в опытах с острым отравлением.

Столь дифференцированный учет всех этапов развития токсического процесса во времени позволяет не только наиболее полно и точно характеризовать границы токсичности того или иного компонента промышленных сточных вод для рыб, но и точно измерить латентный период, скорость развития и время гибели испытуемых рыб. К сожалению, в современных работах по токсикологии рыб произвольно используются только один или два из рассмотренных критериев токсичности вещества, что весьма затрудняет сопоставление данных, полученных в разных лабораториях.

Успешное решение многих вопросов ихтиотоксиколо-гии, связанных с определением степени токсичности различных компонентов промышленных сточных вод, требует унификации используемых критериев, крайне необходимой с точки зрения сопоставимости литературных сведений и координации научно-исследовательских работ по этой тематике. Определенный интерес в этом плане может представить среднее время гибели. Наш личный опыт и литературные данные показывают, что время гибели рыб при неизменной концентрации яда претерпевает чрезвычайно Широкое индивидуальное колебание, вследствие чего получается широко рассеянный вариационный ряд. Распределение частот в таком ряду хотя и приближается к нормальному, однако нередко существенно отклоняется от него.

Если по оси ординат откладывать процент гибели рыб, а по оси абсцисс — промежуток времени, в течение которого наступает летальный эффект, то получим кривую зависимости между временем и процентом погибших животных, называемую кривой время — действие (time — action). Довольно часто она имеет типичную S- образную форму (как и кривая концентрация — действие), подобную той, которую мы получили в опытах с фенолом на карасях (рис. 9). Однако нередко форма этих кривых существенно отличается от S-образной (рис. 10).

Рис. 9. Динамика гибели карасей в растворе фенола (100 мг/л)

Рис. 10. Динамика гибели карасей в растворе фенола (200 мг/л)

В предыдущей главе были изложены способы выпрямления S-образной кривой, один из которых основан на том, что по оси абсцисс вместо времени откладывают его логарифмы, а по оси ординат вместо процента погибших животных — соответствующие пробиты. Иногда зависимость время — действие имеет форму прямой, о чем свидетельствуют результаты наших опытов [188] на сеголетках карася. Графическое изображение полученных данных представлено на рис. 11.

Рис. 11. Динамика гибели сеголетков карася в растворе фенола (50 мг/л)

Имеется несколько методов [454, 668], которые могут быть применены для исследования выпрямленных прямых и определения среднего летального времени LT50, а также стандартной ошибки этого показателя. Обычно на графике находят точки, соответствующие LT16, LT50 и LT84 (т. е. время гибели 16, 50 и 84% испытуемых животных). Стандартную ошибку в этом случае определяют либо по графику (функция наклона прямой), либо по формуле

ХАРАКТЕР ЗАВИСИМОСТИ КОНЦЕНТРАЦИЯ — ВРЕМЯ

Впредыдущих разделах рассмотрено значение двух основных параметров: концентрации яда и времени его действия — в определении выраженности и исхода токсического процесса у рыб. Показано, что изменение концентрации яда при постоянном времени контакта рыб с ядом и изменение времени контакта рыб с ядом при неизменной концентрации вещества влияют на выраженность и исход токсического эффекта. Найденные в опытах соотношения между концентрацией яда, временем его действия и силой токсического эффекта при графическом изображении представляются в виде двух типов кривых: концентрация — действие (concentration

—action) и время — действие (time — action).

Внастоящем разделе будет рассмотрена концентрация — время (concentration — time), которая приобрела в ихтиотоксикологии особое значение. Еще в 1917 г. в результате обстоятельного изучения характера зависимости между концентрацией вещества (соли, кислоты, наркотики) и временем выживания золотой рыбки Е. Пауэре [750] установил, что выше определенной области концентраций время выживания испытуемых рыб обратно пропорционально концентрации яда, и предложил формулу (с—a)t = k, где с — концентрация; а —теоретический

порог; t — время выживания рыб; k — постоянная.

Однако при более низких концентрациях измеряемое время выживания рыб короче, чем это следует из уравнения, а при высоких — больше рассчитанного теоретически. Если составить график, в котором по оси абсцисс откладывается концентрация, а по оси ординат — время выживания, то при интерполяции с экспериментальными данными график имеет более или менее сигмоидную форму и лишь его средняя часть будет

прямой (рис. 12). Если продолжить эту прямую линию до пересечения с осью абсцисс, то точку пересечения условно можно назвать теоретическим порогом токсичности.

Рис. 12. Отношение между временем выживания и концентрацией: а – теоретический порог токсичности [750]

Выводы Е. Пауэрса были подтверждены последующими работами [417, 861, 596]. В. Александер и соавторы [417] на основании опытов с цианистым калием, проведенных на радужной форели, построили график, который имел нелинейную часть и был сходен с графиком Пауэрса. В работе К. Вурмана и X. Вокера [861] описываются результаты опытов, проведенных для установления зависимости между концентрацией фенола и временем гибели различных видов рыб (форель, окунь, гольян). При количественной оценке полученных данных авторы в качестве исходной использовали формулу cnt = k, где с — концентрация яда; t — время гибели; п и k — константы.

Однако полученные экспериментальные данные не совпадали с данными, вычисленными по этой формуле, поскольку фенол, как и другие яды, имеет пороговую концентрацию, ниже которой токсический эффект не проявляется и время отравления — минимальное даже при больших концентрациях. В связи с этим функция cnt = k, представляющая собой гиперболу с равноугольными асимптотами, претерпевала некоторые изменения, если учитывать cs (пороговая концентрация) и минимальное время токсического эффекта ts. С учетом этих поправок формула приобретала следующий вид: (Tм - Ts) (с—Ss)n = k. При логарифмировании и перестановке получаем

log (TT – TS) = k – n log (c - cS).

Иными словами, авторы получили уравнение прямой. График, построенный путем нанесения логарифмов отдельных токсических концентраций (уменьшенных на пороговую концентрацию) и логарифмов времени проявления (уменьшенных на минимальное время реакции), хорошо соответствует графику, в основу которого положены экспериментально найденные величины.

В сообщении Д. Херберта и Д. Меркенса [596] по токсичности цианидов для ручьевой форели указывалось, что получена сигмоидная кривая, аналогичная описанной Е. Пауэрсом и отличающаяся от нее лишь тем, что вместо обратной величины индивидуальных периодов выживания рыб использовали обратную величину среднего периода выживания. Авторы сопоставили демонстративность графиков при нанесении как логарифмов времени выживания, так и обратных величин времени выживания и пришли к выводу, что логарифмическое преобразование имеет явное преимущество. В работе Д. Херберта и Д. Меркенса приводится график (рис. 13), на котором средние периоды выживания при различных концентрациях цианида (в мг/л) нанесены в логарифмическом масштабе. Для определения среднего времени выживания рыб Д. Херберт и Д. Меркенс использовали не обычную статистическую среднюю, а среднее геометрическое из периодов выживания при каждой концентрации яда, найденное по формуле MST = antilog(log T/N), где MST(median survival time) — среднее время выживания рыб; Т — время выживания каждой рыбы; N — число испытуемых рыб.

Рис.13. Отношение между концентрацией цианидов и временем выживавания радужной форели при температуре 17,5°С

В этом случае прямолинейная часть кривой, как и в опытах К. Вурмана и X. Вокера [861], могла быть представлена уравнением cnl = k.

В приведенных работах авторы имели дело с каким-то одним ядом, химическая природа которого известна. Гораздо сложнее рассчитывать токсичность различных комбинаций ядов, встречающихся в сточных водах. Д. Олдердайс и Д. Бретт [415] опубликовали результаты своих наблюдений по токсичности отходов целлюлозного производства для молоди лосося и вывели гиперболический эквивалент для прямой линии U=a+βV, где U — обратная величина средних периодов выживания, V—обратная величина концентрации сточной жидкости. Асимптота β/а характеризует концентрацию сточного материала, безопасную при различной экспозиции. Д. Херберт и др. [598] сообщили о результатах своих опытов по токсичности домашних моющих средств для радужной форели. При нанесении на график логарифмов концентраций моющих средств против логарифмов средних периодов выживания была получена прямая линия, довольно хорошо выраженная уравнением logT = k

— n log c, где T — геометрическая средняя периода выживания; с—концентрация активного материала, мг/л; k = 4,93 и n = 3,71 — постоянные.

Анализируя работы, подтверждающие в той или иной мере обобщение Е. Пауэрса, следует подчеркнуть, что хотя S-образность кривых концентрация — время встречается довольно часто, если имеют дело с альтернативными или квантовыми реакциями, тем не менее экспериментальные данные не всегда интерполируются с кривой этого типа. Имеется большой ряд веществ (кофеин, пиридин, нитрит натрия, хлорид магния и т. д.), для которых интерполяция экспериментальных данных с сигмоидной кривой мало оправдана, особенно в областн токсичности высоких концентраций (на изгибе сигмоиды). К. Карпентер [482] выявил различие между кривой, характеризующей зависимость времени гибели испытуемых рыб от концентрации ряда тяжелых металлов, и кривой Пауэрса. При этом время выживания t было связано с концентрацией с уравнением (1/t)log(l/c)= k, где k — постоянная.

Д. Джонс [626, 632] значительно пополнил список веществ, для которых интерполяция экспериментальных данных с сигмоидной кривой мало оправдана, показав, что для солей серебра, ртути, кадмия, никеля, кобальта, соляной кислоты кривые концентрация — время мало похожи на сигмоидные кривые. Д. Гриндлей [570] обнаружил, что отношение концентрация — время опрокидывания для гольяна, помещенного в раствор мышьяковистого натрия, динитрофената натрия или пикрита натрия, было линейным только в определенной области высокотоксичных концентраций. Сходные результаты были отмечены и при испытании токсичности хромата и бихромата калия на радужной форели.

Можно считать, что форма кривых концентрация — время весьма вариабельна для различных ядов и в известной мере зависит от механизма их действия на организм. Время выживания рыб в токсических растворах, вероятно, определяется механизмом их действия и большим разнообразием других факторов, поэтому следует с известной осторожностью оценивать первые попытки определять токсичность неиспытанных концентраций, исходя из предположения о математическом характере связи концентрация — время. Предложенный Пауэрсом графический метод оценки токсичности неизученных концентраций путем продолжения прямой части S- образной кривой до абсциссы, на которой нанесены концентрации яда, также связан с рядом затруднений. В частности, опытами Д. Джонса [626] показана опасность определения пороговых концентраций ядов только на прямолинейной части кривой и экстраполяции этих данных за пределы, в которых имеет место прямолинейное отношение. Он обнаружил, что выше области концентраций 0,04-0,0015 н. токсичность раствора азотнокислой меди для головастика жабы с разведением возрастала. При нижних концентрациях растворов время его выживания возрастало и было одинаковым в 0,0003 и 0,04 н. растворах. К сожалению, автор не указывает на статистическую проверку достоверности опытных данных.

В наших опытах по определению токсичности фенола для рыб установлено, что в области концентраций 800-200 мг/л время гибели рыб с разведением возрастало, но при дальнейшем разведении (от 200 до 100 мг/л) токсичность резко возросла, и в растворе фенола концентрацией 100 мг/л караси погибали значительно раньше, чем в растворе концентрацией 200 мг/л (рис. 14). Статистическая обработка результатов по методу Вилкокосона выявила достоверность обнаруженных различий в токсичности сопоставляемых концентраций фенола. Впоследствии это наблюдение нашло подтверждение и в опытах с другими видами рыб, когда более низкие концентрации яда обладали более высокой токсичностью (судя по времени выживания рыб). Из этого следует, что хотя время выживания испытуемых рыб с увеличением разведения, как правило, возрастает, однако это имеет место далеко не всегда. Из наших данных следует также, что скорость снижения токсичности раствора яда дри его разведении изменяется весьма неравномерно. Все сказанное приводит к выводу, что оценка токсичности неиспытанных концентраций токсиканта экстраполяцией на кривой должна использоваться с большой осторожностью.

Изучая зависимость токсического эффекта от концентрации яда и времени его действия на организм, Е. А. Веселое [42] прншел к выводу, что для расчета токсичности неиспытанных концентраций токсиканта (по времени гибели) может быть использована формула Габерa w=ct, согласно которой токсический эффект w прямо пропорционален концентрации яда с и времени его действия t на организм, а произведение ct получило еще название токсического коэффициента. Е. А. Веселов считает, что эта формула в ряде случаев применима при обработке данных, полученных на рыбах, и делает при этом оговорку, что произведение ct сохраняет относительное' постоянство только в одной зоне концентраций (летальной или сублеталыюй). В пределах одной зоны, по мнению автора, в случае известной w можно рассчитать время гибели t = w/c для веществ с быстрым токсическим эффектом, в качестве которых он приводит сернокислую медь и фенол.

Известно, что формула Габера, широко применявшаяся ранее, в последние годы редко используется, поскольку даже в пределах одной концентрации яда в опытах с такими веществами, как гексан, толуол, бензол и:

др., характеризующимися замедленным токсическим эффектом, w претерпевает значительные колебания. Вполне понятно, что возможность использования формулы Габера для расчета токсичности неиспытанных концентраций ядов только в какой-либо одной узкой области и притом лишь применительно к веществам с быстрым токсическим действием в значительной мере снижает ее практическое значение. Следует иметь в виду также, что даже у веществ с быстрым токсическим действием w претерпевает чрезвычайно выраженные индивидуальные колебания. Еще в лаборатории В. М. Карасика [108] в опытах на мышах было установлено, что при одном и том же времени воздействия фосгена концентрации, вызывающие гибель отдельных животных, различаются в 4 раза, а в опытах с дифосгеном на кошках амплитуда этих колебаний составила 6,81. На основе полученных данных В. М. Карасик вслед за II. В. Лазаревым [145] ставит лод сомнение возможность широкого использования формулы Габера для количественной интерпретации отношений между концентрацией яда, временем его действия и токсическим эффектом.

В нашей лаборатории в опытах на различных видах рыб показано, что у них фактор индивидуальной устойчивости играет еще большую роль в определении w, чем у теплокровных. Даже в пределах одной зоны летальных концентраций фенола произведение ct под влиянием индивидуальных колебаний устойчивости рыб к яду может меняться в 5-9 раз, а поэтому едва ли формула Габера может быть достаточно эффективной для более точного определения ПДК ядовитых компонентов промышленных сточных вод.

Установление ПДК и особенно пороговых концентраций промышленных сточных вод — задача весьма сложная и никто не может предполагать без риска только путем умозрительных заключений и экстраполяцией на графиках без соответствующих экспериментов, что время выживания животных всегда будет увеличиваться с разведением сточных вод, а их токсичность — уменьшаться.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ

Объективная оценка экспериментальных данных по-степени токсичности различных веществ для того или иного вида рыб, сопоставление уровня токсикорези-стентности различных видов рыб и отдельных стадий их индивидуального развития немыслимы без применения статистических методов. Между тем эти методы все еще не находят должного применения в ихтиотоксико-логии.

Обычно авторы, характеризуя токсичность вещества или степень устойчивости рыб к ядам, используют среднюю арифметическую (М) и лишь изредка другие параметры вариационного ряда. Однако хорошо известно, что сама по себе средняя арифметическая не дает представления о вариабельности учитываемого признака. Кроме того, средняя величина в большей мере зависит от особенностей распределения вариант на концах ряда, где частоты бывают наименее надежны и точны. В связи с этим нередко наряду с определением средней арифметической M=Σx/n (где Σx — сумма отдельных вариант; п — число наблюдений) указывают также центральную варианту ряда — медиану, (Me), и наиболее частую варианту — моду (Мо). Сопоставление Me и Мо со средней арифметической позволяет также составить представление о степени симметрии распределения членов данного вариационного ряда: в случае соавпдения этих трех, величин имеют дело с нормальным распределением. Поскольку главной особенностью любой выборочной совокупности является наличие вариации между ее членами, возникает необходимость измерения степени этой изменчивости. Нередко с этой целью указывают амплитуду ряда распределения, представляющую собой разность между наименьшей и наибольшей величинами, получившими название лимитов ряда. Однако сопоставление лимитов ряда лишь в ограниченной мере характеризует степень изменчивости внутри вариационного ряда, поэтому для определения характера и степени вариации или рассеивания используют среднее квадратичное (стандартное) отклонение

и дисперсию (где Σх2— сумма квадратов отдельных измерений). Строго говоря, δ характеризует амплитуду колебаний М и представляет собой абсолютную величину от М.

При сопоставлении степени вариации отдельных рядов распределения времени гибели (или другого показателя), измеренных в разных единицах, удобнее использовать коэффициент вариации v, показывающий, какую долю от М составляет δ и рассчитывающийся по формуле υ =(δ/М) 100%.

Основные показатели изменчивости величин, составляющих ряд распределений (δ и υ), являются такими же важными параметрами, как и средние величины. Без использования этих показателей, оперируя лишь средними, экспериментатор всегда рискует сделать ошибочное заключение о степени токсичности исследуемого вещества. Таким образом, для описания ряда распределения полученных данных необходимо учитывать не только М, Me и Мо, но и распределение частот вокруг средней и их вариабельность, оцениваемую δ и υ.

Обычно исследователь имеет в своем распоряжении экспериментальные данные, полученные на ограниченном количестве испытуемых рыб и представляющие собой случайные малые выборки, относящиеся к обширному ряду, именуемому генеральной совокупностью. В связи с этим возникает необходимость экстраполяции результатов, полученных в выборочной совокупности, на генеральную совокупность. Опыты показывают, что точность выборочной средней определяется объемом выборки и степенью вариабельности регистрируемой величины. Однако точность выборочной средней изменяется прямо пропорционально не объему выборки, а квадратному корню из этого объема: с увеличением объема выборки в 100 раз точность средней возрастает в 10 раз.. Это следует иметь в виду при определении числа испытуемых рыб в токсикологических опытах для выявления эффективной концентрации яда и среднего времени токсического эффекта [861].

Критерием точности средней арифметической М служит средняя ошибка (тм) средней арифметической,

высчитываемая по формуле , где б — среднеквадратичное отклонение от выборочной средней. Один из наиболее важных моментов при статистической обработке экспериментальных данных —

определение достоверности различия между сравниваемыми величинами, совершенно необходимое при характеристике относительной токсичности различных компонентов промышленных сточных вод или отдельных пестицидов, а также при оценке роли факторов водной среды в изменении этой токсичности. Вполне понятно, что оценка достоверности выявленных различий имеет первостепенное значение при описании экологических, видовых и возрастных особенностей устойчивости рыб к ядам.

Существует несколько способов определения достоверности различия. По одному из них различие считается достоверным, если разница между двумя средними:

Другой способ основан на использовании критерия t, вычисляемого по формуле

где М1 к М2 — сравнимые средние арифметические; Σ(х1 — M1)2 и Σ(х2 — М2)2 — сумма квадратов отклонений членов вариационного ряда от их средних арифметических; n1 и п2 — количество наблюдений.

Полученный t сопоставляют с значением t, указанным в строке с определенным количеством животных, вычисленным по формуле f = n1+n2-2 в специальной таблице.

В том случае, когда количество испытуемых животных в двух сопоставляемых сериях опытов одинаково (n1 = n2), критерий может быть установлен по более простои формуле

Хотя в некоторых случаях [861, 596] опытным путем удавалось показать, что распределение частот времени проявления или времени опрокидывания находится в соответствии с нормальной кривой, однако чаще в работах по токсикологии рыб нормальное распределение лишь предполагается без достаточных экспериментальных данных. В связи с этим в тех случаях, когда характер распределения полученных экспериментальных данных неизвестен, предпочтительнее использовать в качестве показателя достоверности различия двух рядов распределения непараметрический критерий Вилкоксона, основанный на числе инверсий. Для каждой пары рядов распределения вычисляют математическое ожидание М числа инверсий и по формуле Ми= (mn)/2 (где m и n — количество наблюдений в каждом ряду) и среднеквадратичное

Приняв уровень значимости критерия q = 5% рассчитывают область больших по абсолютной величине отклонении u = Mu ± 1*96δu и определяют положение полученного числа инверсий относительной этой области.

Важное преимущество использования непараметрического критерия Вилкоксона перед другими методами оценки достоверности выявляемого различия состоит в том, что он применим при обработке экспериментальных данных, как соответствующих нормальному распределению, так и отклоняющихся от него.

ГЛАВА V

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИХТИОТОКСИКОЛОГИИ

Еще в начале 60-х годов нами была предпринята попытка привлечь внимание отечественных ихтнотоксикологов к возможности использования биохимических показателей для ранней диагностики токсического процесса у рыб, т. е. до проявления клипической картины отравления и тем более гибели рыб. Особые надежды мы возлагали на возможность использования биохимических индикаторов для выявления токсического эффекта малых (пороговых) концентраций ядовитых веществ. В случае положительного решения этого вопроса открывались новые перспективы в решении центральной задачи ихтиотоксикологии — определении ПДК токсических веществ, поступающих в рыбохозяйственные водоемы. Напомним, что именно пороговые концентрации, т. е. минимальные концентрации, вызывающие нарушение нормальной жизнедеятельности рыб, являются той отправной точкой экспериментального анализа, который должен привести к установлению ПДК токсикантов, не оказывающих токсического эффекта при неопределенно долгом контакте рыб с этими веществами.

Приступая к разработке биохимического подхода к решению важнейших задач ихтиотоксикологии, таких, как ранняя диагностика отравлений, установление пороговых и предельно допустимых концентраций, мы понимали, что решение двух последних задач возможно только на основе вскрытия биохимических механизмов

токсического действия различных групп веществ, т. е. первичных и вторичных биохимических изменений в организме, обусловленных воздействием токсиканта. Знание токсикодииамики того или иного вещества, механизмов его действия на организм рыб позволяет выбирать адекватные методы для оценки пороговых и предельно допустимых концентраций этих веществ и тем самым значительно сокращать время проведения экспериментов, направленных на выявление ПДК. токсических веществ.

Исходя из этого, нами проведен цикл исследований, выполненных в 1963-1964 гг. в Институте биологии водохранилищ АН СССР иа модели фенольной интоксикации налимов, лещей и карасей, а затем в 1965-1966 гг. в Центральном институте осетрового хозяйства — на севрюге и русском осетре. Для оценки характера и глубины биохимических изменений в организме рыб под влиянием токсических веществ были, использованы показатели, характеризующие белковый (концентрация общего сывороточного белка и его отдельных фракций, коллоидная устойчивость сывороточных белков, концентрация аммиака в мозге) и углеводный обмен (сахар крови), а также содержание аскорбиновой кислоты в мозге, активность сывороточной и мышечной холинэстеразы.

Некоторые результаты этих исследований [184, 185, 195] были представлены в первом издании настоящей книги [163]. Вопреки ожиданиям биохимический подход к решению основных проблем ихтиотоксикологии и водной токсикологии встретил у отдельных иследователей [329, 332] негативное отношение. Так, Н. С. Строганов писал: «Основными показателями токсичности водной среды должны быть плодовитость и качество потомства. Физиологические и особенно биохимические (разрядка наша — В. Л.) нарушения могут использоваться как показатели второстепенные, дополнительные к этим основным, в первую очередь в тех случаях, когда речь идет о грубом (?!) воздействии токсиканта» [329, с. 22-23]. К сожалению, подобные ничем не аргументированные представления сыграли отрицательную роль в деле организации биохимических исследований в токсикологических лабораториях и задержали их развитие почти на десятилетие. Только в середине 70-х годов эти исследования стали занимать важное место в работах ихтиотокси-кологов, а их плодотворность и перспективность теперь общепризнаны. Накопленный отечественными и зарубежными исследователями опыт однозначно свидетельствует о том, что различные группы токсикантов вызывают глубокие изменения биохимического состава и обмена веществ у рыб задолго до их гибели, а многие биохимические показатели могут быть использованы для диагностических целей.

ВЛИЯНИЕ ТОКСИКАНТОВ НА ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ РЫБ

Белковый обмен

Многогранная физиологическая роль тканевых и сывороточных белков, а также способность чутко отражать изменения интенсивности и направленности обменных процессов, в частности пластического обмена, позволяют использовать их в качестве важнейшего биохимического показателя функционального состояния организма как в норме, так и при воздействии экстремальных раздражителей химической природы, в том числе и токсических веществ.

В первой серии опытов, выполненной нами совместно с Л. А. Петуховой весной и осенью 1963 г. на двух массовых видах рыб Рыбинского водохранилища — леще (Abramis brama) и налиме (Lota lota), в качестве токсиканта была использована сублетальная концентрация фенола (5 мг/л). Предварительными опытами было установлено, что увеличение концентрации фенола до 10 мг/л приводит к 100%-ной гибели налимов в среднем за 2 ч 45 мин и к 20%-ной гибели лещей за 14 ч. Опыты проводились по следующей схеме. Рыб помещали в 150литровые плексигласовые аквариумы с раствором фенола на 24, 48, 96, 120 и 144 ч (по три особи на каждую временную точку). Растворы фенола аэрировали и меняли через каждые 24 ч. Опыты проходили при следующих условиях: температура 6-8°С, содержание кислорода 7,8-9,0 мг/л, рН 7,1-7,3, жесткость воды 9-10°Н. По истечении заданного срока (каждые 24 ч) путем каудоктомии брали кровь из хвостовых сосудов рыб и с помощью рефрактометра ИРФ-22 определяли содержание в ней общего сывороточного белка. В опытах использовано 68 налимов и 23 леща.

Результаты сравнительного изучения содержания общего сывороточного белка у двух резко различающихся по уровню двигательной активности видов рыб, подвергнутых воздействию фенола, представлены в табл. 12. Их анализ показывает, что выраженность отмеченных изменений зависит от длительности субтоксического воздействия.

Таблица 12

Влияние субтоксической концентрации фенола на содержание общего сывороточного белка (в %) у налимов и лещей.