4 курс / Общая токсикология (доп.) / Obschaya_ikhtiotoxikologia_Lukyanenko

Наибольшее снижение концентрации сывороточного белка как у малоподвижных налимов (на 13%), так и у более подвижных лещей (на 11%) отмечено в конце наблюдений, причем у налимов в первые 4 сут контакта рыб с ядом имело место некоторое увеличение концентрации белка. Однако в целом обнаруженная нами у подопытных рыб гипопротеинемия незначительна. Она указывает скорее на направленность изменений белкового обмена в случае более длительного контакта рыб с фенолом. Свидетельством тому могут служить материалы Н. А. Лебединского и В, Л. Помаржанской [152], полученные ими в более длительных (30-суточных) опытах на сеголетках карпа. Фенол в концентрации 0,1 мг/л в течение указанного срока наблюдений не оказывал скольконибудь заметного влияния на содержание общего сывороточного белка. Десятикратное увеличение концентрации фенола (до 1 мг/л) привело к снижению содержания сывороточного белка па 10% (с 3,84 до 3,48%), т. е. сопоставимого с тем, что мы наблюдали в опытах на лещах и налимах с концентрацией фенола 5 мг/л при 5-6- суточной экспозиции. Лишь концентрация фенола 10 мг/л при 30-суточной экспозиции вызвала у сеголетков карпа выраженную гипопротеинемию: снижение уровня белка на 26 % (с 3,84 % в контроле до 2,86 % в опыте).

Месячное выдерживание сеголетков карпа в растворе фенола концентрацией 25 мг/л вызвало падение концентрации сывороточного белка с 3,84 до 1,74%. Столь высокую концентрацию фенола (25 мг/л) способны выдержать, видимо, только сеголетки карпа, поскольку для взрослых карпов она является остротоксичной.

Мы сопоставили результаты этой последней серии опытов с данными, полученными также на модели фенольного отравления сеголетков карпа, но в более продолжительных (2-месячных) опытах с меньшей концентрацией фенола — 12,5 мг/л [64 а]. Оказалось, что в этом случае у сеголетков, подвергнутых хроническому отравлению фенолом, получавших корм, концентрация общего сывороточного белка снизилась всего лишь на 19% (с 6,71 до 5,45 г%), а у рыб, не получавших корма, — на 36% (с 2,21 до 1,42 г%). Значитедьно более выраженные, а главное, скоротечные изменения концентрации общего сывороточного белка отмечены нами у молодя осетровых, отравленной различными пестицидами. В серии экспериментов, проведенных совместно с А. А. Кокозой, А. П. Берилло, А. Б. Захаровым и аспирантом из Уганды Самуилом Мукасой, на 2-4-месячной молоди русского осетра и белуги, мы исследовали сравнительную токсичность трех широко применяемых в сельском хозяйстве пестицидов; метафоса из группы фосфорорганических соединений, пропанида — производного пролионовой кислоты и ялана — производного тиокарбаминовой кислоты. Опыты ставили в стеклянных аквариумах или эмалированных ваннах вместимостью 150 л. Токсические, растворы каждого из трех пестицидов аэрировали на протяжении всего периода наблюдений при помощи воздуходувного компрессора. Растворы меняли через каждые 6-12 ч. В острых опытах длительностью 24-48 ч использовали следующие концентрации пестицидов (в мг/л): метафос 16,6, пропанид 26,6, ялан 50. Подострые опыты ставили с концентрациями пестицидов, вдвое меньшими, т. е. 8,3 мг/л, 13,3 н 25 мг/л соответственно. Продолжительность наблюдений 1012 сут. Обе серии опытов проводили при температуре воды 20-27° С, содержании кислорода 6-9 мг/л, рН 7,5-8,0.

Согласно полученным данным (табл. 13), исследованные пестициды оказывают существенное влияние на уровень протеинемии как в острых, так и в подострых опытах. Сказанное в первую очередь относится к метафосу.

Таблица 13.

Влияние трех пестицидов на концентрацию общего сывороточного белка ( в г%) у молоди белуги и русского осетра.

Примечаяие. В числителе — концентрация белка у контрольной группы в остром опыте; в знаменателе —

концентрация белка у контрольной группы в подостром опыте.

Острое отравление метафосом молоди белуги привело к снижению концентрации сывороточного белка почти на 50%, яланом — на 40% и пропанидом — на 30%. Подчеркнем, что столь глубокие сдвиги уровня протеинами развились в течение 24 ч контакта рыб с ядом.

Трудно объяснить истинную причину глубокого и стремительного снижения концентрации сывороточного белка. Возможно, оно связано с перераспределением белка между тканями и кровью или снижением процессов биосинтеза белка печенью. Однако нельзя исключить в качестве причины столь резкой гипопротеинемии и нарушение водно-солевого обмена, вследствие которого могло произойти «разжижение» крови. Этот вопрос заслуживает специального изучения.

Сходные по направленности и выраженности изменения общего сывороточного белка отмечены и в подострых опытах с молодью белуги, длившихся 10 сут. Исключение составляет ялан, подострое отравление рыб которым привело к снижению концентрации сывороточного белка лишь на 13% против 40% при остром

.отравлении. В опытах же с пропанидом отмечена противоположная картина: при длительном его воздействии на рыб концентрация белка снизилась на 59% против 30% при остром отравлении. Только в опытах с метафосом отмечено примерно одинаковое (по 50%) снижение концентрации сывороточного белка при острой и подострой концентрации токсиканта.

Несколько иная картина выявляется при анализе результатов определения сывороточного белка у молоди русского осетра, подвергнутой воздействию тех же трех пестицидов: при остром отравлении рыб яланом и метафосом концентрация сывороточного белка снизилась на 24 и 15% (соответственно) и практически не изменилась (даже несколько повысилась) в опытах с пропанидом. Снижение концентрации исследованных пестицидов вдвое и увеличение времени наблюдений до 12 сут оказали более выраженный токсический эффект: концентрация сывороточного белка более всего снизилась у мальков русского осетра, отравленных метафосом,

— на 50,5%, затем у мальков, отравленных яланом, — на 32%, и только у мальков, отравленных пропанидом, она снизилась всего лишь на 6%.

Анализ полученных данных приводит к выводу о том, что воздействие на рыб любого из исследованных пестицидов снижает содержание общего сывороточного белка, оказывая, по-видимому, гепатотропное действие. Наиболее выражено оно при воздействии на организм метафоса я проявляется как в острых, так и в подострых опытах. Выраженность гипопротеииемического эффекта пестицидов определяется их концентрацией, временем действия на организм и видовыми особенностями ток-сикорезистентности рыб.

Безусловно, концентрация общего сывороточного белка является важным интегральным показателем белкового обмена, его направленности и интенсивности. Как показали наши исследования, она претерпевает существенные изменения под влиянием токсикантов различной природы. Однако для более глубокого понимания характера воздействия токсикантов на белковый обмен у рыб необходимо раскрытие механизмов изменения уровня протеинемии, т. е. выявление именно тех фракций белкового состава сыворотки крови (альбуминов, α-, β-

иγ-глобулинов), за счет которых снижается концентрация общего сывороточного белка. Теоретически мыслимы варианты, когда тот или иной токсикант может оказывать угнетающее воздействие, скажем, на синтез альбуминов

истимулировать образование одной из фракций глобулинов.

Экспериментальная проверка высказанных соображений была осуществлена нами в 1965 г. в опытах на ссвсрокаспийской севрюге, подвергнутой токсическому воздействию сточных вод сложного состава, в которых ведущая роль принадлежала ядам органического ряда с преимущественным действием на кровь [183]. Электрофоретическнй анализ сывороточных белков у подопытных севрюг с выраженными клиническими признаками отравлеиия выявил существенные изменения относительного содержания основных фракций (альбуминов и глобулинов) по сравнению с их количеством у контрольных (здоровых) севрюг. У отравленных севрюг содержание альбуминов (25,6%) оказалось заметно ниже, чем у здоровых рыб (34,3%), а содержание глобулинов, напротив, выше (74,3%), чем у контрольных рыб (65,7%). В соответствии с этим альбуминглобулиповый коэффициент у подопытных рыб (0,35) на 34% ниже, чем у контрольных (0,53). Еще более существенные различия между подопытными и контрольными севрюгами выявляются при сопоставлении у них относительного содержания отдельных фракций глобулинов. Так, относительное содержание α-глобулинов у отравленных рыб (13,8%) в 2 с лишним раза выше, чем у здоровых (6,4%), а содержание β-глобулинов в 3 с лишним раза выше (27,3 % и 8,0 % соответственно), в то же время содержание высокомолекулярных (наименее подвижных) белков β2-глобулинов+γ-глобулинов (методом электрофореза на бумаге их трудно разделить) у отравленных севрюг (33,1%) значительно ниже, чем у здоровых (51,1%).

Основные результаты электрофоретического анализа сывороточных белков у подопытных и контрольных рыб были подтверждены с помощью одной из наиболее чувствительных проб коллоидоустойчивости белков — коагуляционной ленты Вельтмана [183]. Из 13 обследованных рыб только у одной особи коагуляционная проба оказалась в пределах нормы — 6-7 ед., у остальных рыб лента Вельтмана была смещена резко влево (2-3 ед.), что свидетельствует о серьезном нарушении в соотношении альбумин-глобулинов, увеличении грубодисперсиых фракций глобулинов и понижении коллоидной устойчивости белков. Результаты этой серии опытов однозначно свидетельствуют о нарушении нормального хода синтеза белка и угнетении функционального состояния печени отравленных рыб.

Совокупность полученных нами в середине 60-х годов данных однозначно свидетельствует о влиянии различных групп токсикантов на белковый обмен, что находит свое отражение в изменении концентрации общего

сывороточного белка и его основных фракций (альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов).

В дальнейшем этот вывод был неоднократно подтвержден и тем самым экспериментально обоснована принципиальная возможность использования сывороточных белков в качестве биохимического показателя токсического действия различных групп веществ [127, 227, 71, 291, 80, 114, 122, 236]. Приведем лишь некоторые примеры.

Отравление карпов различными пестицидами вызывает изменение концентрации сывороточных белков и их отдельных фракций, однако направленность этих изменений и их выраженность определяются природой токсиканта и его концентрацией [227]. Воздействие фторсодержащих ядохимикатов на рыб снижает концентрацию общего сывороточного белка (примерно на 20%) и альбуминов, но увеличивает содержание глобулинов. Однонаправленные, но более выраженные (до 39%) изменения концентрации общего сывороточного белка отмечены в острых (24-72 ч) и хронических (60 сут) опытах с гербицидом 2,4-Д. Отравление рыб севином (производным карбаминовой кислоты) в острых опытах вызывало снижение концентрации общего сывороточного белка на 23%, а в хронических опытах имели место маловыраженпые изменения. Разнонаправленные и к тому же незначительные сдвиги уровня протеинемии зарегистрированы в опытах с тремя фосфорорганическими пестицидами. Острое отравление карпов метилнитрофосом (МИФ) снижает содержание общего сывороточного белка, а также α- и β-глобулинов. Фосфамид не оказывает влияния на фракционный состав сывороточных белков, но несколько (на 10%) снижает содержание общего сывороточного белка. Наконец, трихлормстафос (ТХМ-3) несколько увеличивает содержание α- и γ-глобулннов, а также общего сывороточного белка.

Значительно более выраженные изменения со стороны сывороточных белков выявлены в опытах на карпах с другим пестицидом фосфорорганического ряда — бензофосфатом [71]: острое отравление рыб (96 ч) вызвало гппопротеинсмию и снижение концентрации альбуминов на 33,9%, β-глобулинов на 19,7% и γ-глобулинов на 26%. В хронических опытах, продолжавшихся около 3 мес, отмечена статистически недостоверная тенденция к снижению концентрации общего белка и основных его фракций.

Противоположные по направленности изменения уровня протеинемин описаны у личинок севрюги, подвергнутых воздействию двух фосфорорганических пестицидов: метиднитрофоса и изофоса [129]. Воздействие на рыб высоких концентраций этих пестицидов (0,1 и 1 мг/л) приводило к увеличению содержания общего белка на 20-30%, а более низкие концентрации не оказывали никакого влияния.

Еще одно исследование белкового состава сыворотки крови карпа, отравленного хлорофосом (из группы фосфорорганических пестицидов) и полихлорпиненом (из группы хлорорганических пестицидов), выполнено В. И. Козловской и др. [122]. Привлекает внимание скоротечное изменение уровня протеинемии и соотношения альбумин-глобулинов при остром отравлении рыб хлорофосом. Уже через 3 ч после воздействия на них раствора хлорофоса концентрацией 500 мг/л содержание общего сывороточного белка увелйчивается на 62% (с 21,3 до 35,5 мг/л), остается примерно на этом уровне в течение 7 ч и лишь через 24 ч (видимо, незадолго до смерти) несколько снижается (до 28,5 мг/л), но все еще остается выше (на 34%), чем у здоровых карпов. Одновременно с этим происходит увеличение относительного содержания альбуминов на 47% и снижение глобулинов примерно на 20%.

В отличие от хлорофоса полихлорпинен концентрацией 1 мг/л вызывает повышение содержания общего белка только после 7-часового контакта рыб с ядом, а через 24 ч оно достигает наивысшего уровня — 49,1 мг/л у отравленных карпов против 29,4 мг/л у здоровых, т. е. увеличивается на 67%. Относительное содержание альбуминов и глобулинов не претерпевает существенных изменений, и остается непонятным, за счет чего у рыб произошло увеличение концентрации общего сывороточного белка. Примечательна еще одна деталь. В подострых опытах с обоими пестицидами, длившихся 6 сут (ежедневно в аквариум вносили по 1/10 остаотоксичной концентрации), на электрофореграммах отравленных рыб в области альбуминов и глобулинов наблюдалось увеличение количества белков. Однако определение концентрации общего сывороточного белка спектрофотометрическим методом выявило тенденцию к ее снижению. Авторы не объясняют этих расхождений.

Следует отметить, что результаты, их, опытов с хлорофосом, согласно которым у отравленных рыб происходит увеличение относителыгого содержания альбуминов и снижение глобулинов, находятся в противоречии с многочисленными литературными данными по влиянию на сывороточные белки рыб ядов органического ряда, в том числе и пестицидов [183, 1'27, 227, 71]. Из этих данных следует, что при изменении уровня протеинемии относительное содержанке альбуминов всегда, снижается, а относительное содержание α- и β-гдобулинов, как правило, увеличивается. Такое направление изменений становится понятным, если учесть, что печень, представляющая собой основной орган, в котором происходят процессы детоксикации чужеродных веществ (ксенобиотиков), одновременно - является и местом синтеза альбуйинов. При нарушениях функций печени у отравленных рыб должен угнетаться и синтез альбуминов.

Что касается повышения содержания грубодисперсных белков α-, β- и γ-глoбyлинoв, то оно может определяться эксудативно-пролиферативными процессами, развивающимися в организме отравленных рыб. Возвращаясь к данным В. И. Козловской с соавторами [122] об увеличении относительного содержания альбуминов и снижении глобулинов, необходимо отметить, что авторы использовали в своих опытах метод дискоэлектрофореза в полиакриламидном геле. Это один из наиболее совершенных методов, характеризующийся высокими разрешающими способностями. Однако идентифицировать на дискофореграммах отдельные фракции белков у костистых рыб чрезвычайно трудно. Не исключено, что именно эти трудности и послужили одной из причин ошибочного вывода об увеличении относительного содержания альбуминов у карпов, подвергнутых

воздействию высевкой концентрации хлорофоса (500 мг/л).

В литературе имеются указания на изменения содержания сывороточных и тканевых белков у рыб и под влиянием других токсических веществ. Так, введение рыбам (S. guingueradiata) четыреххлористого углерода в дозе 0,1-0,2 мг на 100 г массы приводило к снижению концентрации сывороточных альбуминов и увеличению глобулинов. Кроме того, по мнению авторов, на протеинограммах отравленных рыб появлялись новые компоненты, вследствие чего общее количество их увеличивалось [766]. Аналогичные качественные изменения фракционного состава сывороточных белков отмечены несколько ранее [428] у одного из видов пресноводных рыб (Channa punctatus) при действии сублетальных концентраций двух фосфорорганических инсектицидов (базудина и метилпаратиона), а затем и у карпов, отравленных хлорофосом и полихлорпиненом [122]. Однако при действии на сигов сточных, вод сложного химического состава происходит некоторое обеднение фракционного состава мышечных белков (миогенов) за счет выпадения отдельных компонентов [325].

Хотя мышечные белки по фракционному составу и количественному содержанию более стабильны, чем сывороточные белки, но и они претерпевают изменения под влиянием различных токсических веществ. Некоторые тяжелые металлы, например, такие, как медь, хром, олово и кадмий, снижают содержание растворимых мышечных белков у рыб [483]. Снижается оно и под влиянием нефтяного загрязнения [94]. Вообще токсическое действие тяжелых металлов и нефтепродуктов проявляется в изменении содержания не только мышечных, но и сывороточных белков рыб. Воздействие на рыб ртути и свинца, например, вызывает снижение концентрации общего сывороточного белка и альбуминов, но приводит к увеличению концентрации α- и β- глобулинов [80]. Направленность этих изменений и их характер аналогичны отмеченным нами в опытах с ядами органического ряда [183]. Снижение концентрации общего сывороточного белка у рыб (белуги, сазана) отмечено и в опытах с растворенной нефтью [114]. Для понимания механизмов изменения концентрации сывороточных и тканевых белков несомненный интерес представляют материалы, полученные Л. В. Михайловой [236] в опытах на различных видах рыб (карась, карп, пелядь) с растворимой фракцией нефти (ВРФН). Помещение подопытных карасей в токсический раствор, содержащий 0,05-0,1 мг/л ВРФН, уже через 3 ч приводило к снижению скорости включения мстионина-35 в белки печени и почек и снижению концентрации белка в этих органах, характеризующихся, как известно, высокой метаболической активностью. Таким образом, изменение скорости и интенсивности биосинтеза белка — один из реальных механизмов воздействия токсических веществ на обмен веществ рыб, а изменение концентрации общего сывороточного или тканевого белка — хороший биохимический показатель как острого, так и хронического отравления рыб.

Другим важнейшим биохимическим показателем токсического действия различных групп веществ на белковый обмен может служить уровень содержания аммиака в крови и тканях, прежде всего в мозговой ткани. Как известно, рыбы (наряду с ракообразными) относятся к группе аммониотелических животных, у которых конечным продуктом катаболизма белков и аминокислот является аммиак. Аммиак и его водный раствор аммоний высокотоксичны. В нормальных условиях образующийся в различных тканях аммиак детоксици-руется с помощью глютаминовой кислоты. Взаимодействие аммиака и глютаминовой кислоты ведет к образованию глютамина, который поступает в печень, где от него отщепляется аммиак. Нарушение этих тонко сбалансированных процессов образования и детоксикации аммиака в центральной нервной системе теплокровных животных приводит к развитию двигательного возбуждения и судорожного состояния. Однако все имевшиеся к началу 60-х годов экспериментальные данные были получены на теплокровных животных, а динамика изменений количества аммиака во время судорожного приступа у рыб оставалась вне поля зрения исследователей. Между тем многие яды органического ряда, в частности фенолы, вызывают у рыб бурное двигательное возбуждение с последующими судорогами. Учитывая это обстоятельство, мы решили провести специальное исследование для выявления роли аммиака в происхождении основных симптомов отравления рыб ядами органического ряда.

Опыты проводили на модели фснольной интоксикации карасей (Carassius carassius) в 1962-1963 гг. [184, 185]. В обшей сложности в опытах использовано 166 рыб 3-4-летпего возраста. Подопытные и контрольные караси, отловленные в одном пруду, содержались в 300-литровых плексигласовых аквариумах с проточной водой. После отлова рыб выдерживали в аквариалыюй в течение 7-10 сут. Опыты проводили при температуре 15°С, рН 7,1, содержании кислорода 5,9-6,4 мг/л и жесткости 10,3°Н. Подопытных карасей погружали в раствор фенола (100 мг/л), что вызывало у них развернутую картину фенолыюй интоксикации со всеми характерными для нее симптомами: двигательным возбуждением, опрокидыванием на бок, манежными движениями и судорогами. Для того чтобы проследить за динамикой содержания аммиака в головном мозге по ходу развития фенольной интоксикации, определяли его количество через 7, 15, 30, 60 и 120 мин контакта рыб с фенолом микродиффузионным методом в прописи В. С. Асатиани [17]. Результаты опытов подвергали статистической обработке с помощью непарамстрического критерия Вилкоксона.

Изучение количества аммиака в головном мозге карасей на разных этапах развития фенольной интоксикации показало, что этот конечный продукт белкового обмена претерпевает существенные изменения (табл. 14): в четырех из пяти серий опытов было отмечено резкое увеличение количества аммиака (в 2 раза больше, чем в контроле). Сопоставляя динамику изменения количества аммиака в мозге с качественным составом внешнего симптомокомплекса фенолыюй интоксикации, можно заключить, что количество аммиака претерпевает 2-фазовое изменение параллельно с 2-фазовым протеканием фенольного отравления карасей.

Уже через 7 мин после погружения испытуемых карасей в раствор фенола, во время которых имеет место чрезвычайно сильное локомоторное возбуждение, количество аммиака в головном мозге увеличивается в 1,9 раза

в сравнении с его исходным уровнем. В последующие 15 мип беспорядочная бурная двигательпая активность постепенно идет на убыль, рыбы теряют рефлекс равновесия и находятся в боковом положении, сопровождающемся интенсивными клоническимн судорогами. Количество аммиака в головном мозге подопытных карасей по-прежнему остается высоким: в 1,8 раза превышает его содержание у контрольных карасей. Даже к 30-й минуте, когда у большинства подопытных рыб отмечается полная потеря двигательной активности, количество аммиака все еще в 1,7 раза превышает его содержание у контрольных рыб.

Через 60 мин после погружения рыб в токсический раствор фенола первая стадия возбуждения, включающая такие характерные реакции, как бурная двигательная активность, потеря рефлекса равновесия и импульсивное перемещение в боковом положении, сменяется стадией торможения, характеризующейся в основном полным угнетением дыхания, потерей ориентировочной реакции и резким ослаблением чувствительности к механическим раздражителям. Количество аммиака в мозге у опытных рыб в это время хотя и остается выше (в 1,27 раза), чем у контрольных, однако оно значительно меньше, чем у подопытных карасей, находившихся в контакте с фенолом первые 15 мин. И наконец, через 120 мин после появления первых симптомов фенольного отравления количество аммиака в мозге у подопытных карасей резко падает и оказывается даже несколько меньше, чем у контрольных рыб.

Таблица 14.

Содержание аммиака (в мг на 1 г. ткани) в головном мозге карасей через различные промежутки времени после погружения в раствор фенола концентрацией 100 мг/л

Таким образом, динамика изменения количества аммиака в мозге у карасей (рис. 15) по ходу развития фенольной интоксикации отражает серьезные сдвиги в белковом обмене организма, обусловленные воздействием фенола на центральную нервную систему рыб. Опыты отчетливо показывают, что в головном мозге рыб происходит резкое повышение концентрации аммиака во время двигательного возбуждения и судорог, характерных для фенольной интексикации. Иными словами, биохимические изменения в головном мозге рыб вовремя сильнейшего двигательного возбуждения аналогичны имеющим место у теплокровных и животных.

Рис. 15. Динамика изменений количества аммиака в мозге у контрольных 1 и подопытных 2 карасей.

Сходство биохимических изменений в головном мозге рыб и теплокровных, проявляющееся в увеличении содержания высокотоксичного аммиака, позволило нам высказать предположение [185] о нарушении детоксикации аммиака у рыб в системе дикарбоновые кислоты — аммиак — глютамин. Постоянство и выраженность изменений количества аммиака в мозге рыб давали основание думать, что ему принадлежит важная роль в патогенезе судорожного состояния, обусловленного воздействием на организм не только фенолов, но и других ядов органического ряда. Последующее развитие исследований, проведенных на рыбах, подтвердило эти предположения.

Например, отмечено увеличение концентрации аммиака в мозге радужной форели под влиянием одного из хлорорганических пестицидов — диелдрина, поступавшего в организм рыб вместе с кормом [707]. Одновременно с этим повышалась концентрация свободных аминокислот, в частности аланина, глютаминовой и аспарагиновой кислот, играющих важную роль в детоксикации аммиака.

Освобождение аммиака и увеличение его концентрации в головном мозге различных видов рыб (вобла, бычок-кругляк, осетр) отмечено в опытах с нефтью, ртутью, свинцом н кадмием [18, 19]. Выраженность этих

изменений, их продолжительность определяются видовыми особенностями рыб, временем контакта их с ядом и природой токсиканта.

Так, сырая нефть концентрацией 40 мл/л вызывает у отравленных рыб увеличение содержания аммиака на 80%, глютамина на 25% и глютаминовой кислоты на 26%. Меньшая концентрация вытяжки из нефти (30 мл/л) приводит к повышению содержания аммиака в головном мозге русского осетра на 167%, глютамина на 52% и глютаминовой кислоты на 43%.

Однонаправленные изменения азотистого обмена в головном мозге рыб выявлены и в опытах с ядами неорганического ряда, в частности с тяжелыми металлами. Длительное воздействие двухлористой ртути в концентрации 0,01 мг/л привело к увеличению содержания аммиака в головном мозге осетра на 290%, воблы на 135% и бычка-кругляка на 120%. По-иному, чем в опытах с нефтью, менялось содержание днкарбоновых аминокислот: содержание глютамина в мозге всех видов рыб снижалось при ртутной интоксикации. Что касается глютаминовой кислоты, то ее концентрация у осетра снижалась, а у двух видов костистых рыб (вобла и бычоккругляк) возрастала.

Аналогичные изменения отмечены и в опытах с двумя другими тяжелыми металлами: свинцом и кадмием, выполненных также на полупроходной вобле и морском бычке-кругляке. Содержание аммиака в головном мозге рыб в первые сутки опыта увеличивалось более чем в два раза, затем снижалось и вновь повышалось к концу 15суточных наблюдений. Менее определенные сдвиги отмечены при исследовании содержания днкарбоновых аминокислот: количество глютаминовой кислоты несколько увеличивалось, глютамина — снижалось, а аспарагиновой кислоты — существенно не менялось. Все зарегистрированные изменения в системе глютаминовая кислота — аммиак — глютамин имеют место при действии на рыб тяжелых металлов в концентрациях, близких к ПДК. Следовательно, содержание свободного аммиака в мозговой и других тканях рыб, появляющегося в избытке вследствие нарушения механизмов его детоксикации, может служить тонким биохимическим показателем реакции организма на токсические воздействия различных групп химических веществ.

Помимо уже описанных токсикантов (фенол, диелдрин, нефть, ртуть, свинец и кадмий) на уровень аммиака в тканях, в частности в крови, печени и жабрах, заметное влияние оказывает повышенное содержание углекислоты в воде [89]. Повышение уровня р СO2 в воде с 0,21 ммоль/л (в контроле) до 0,44 ммоль/л (1-я группа подопытных карпов) н затем до 0,84 ммоль/л (2-я группа подопытных карпов) привело к увеличению содержания аммиака в крови и печени рыб как 1-й (на 45,9 и 20,4% соответственно), так и 2-й группы (66,6 и 32,6% соответственно). Одновременно нарастает концентрация аммиака в жабрах подопытных рыб обеих групп (на 33,3 и 88,9% соответственно), что свидетельствует об увеличении его выделения жабрами. Поскольку подопытные рыбы в течение длительного времени не питались, авторы высказывают справедливое предположение о том, что увеличение концентрации аммиака в тканях под влиянием повышенного уровня углекислоты обусловлено усилением катаболизма белков и интенсификацией дезаминирования глютамина, концентрация которого увеличивается в крови и тканях, но снижается в печени (на 14,9—24,5%) в сравнении с его содержанием у контрольных рыб.

Результаты этих опытов согласуются с более ранними наблюдемиями [685, 686] о влиянии на обмен азотсодержащих веществ в организме повышенных концентраций водородных ионов. Снижение рН воды (закисление среды) приводит к угнетению поглощения натрия и, естественно, к его утечке из организма. Развивающееся при кислотном стрессе обессоливанис вызывает ряд серьезных сдвигов в обмене веществ рыб, в том числе уменьшение концентрации сывороточного белка [245]. Снижение концентрации натрия в крови карасей приводит к резкому (пятикратному) увеличению содержания аммония [686]. Эти изменения не являются неожиданными, поскольку ионы натрия, а также хлора принимают участие в регуляции активности глютаматдегидрогеназы [773], играющей главную роль в метаболизме аммиака.

Обобщая накопленные экспериментальные данные по влиянию различных экстремальных воздействий на азотистый обмен рыб, необходимо сделать вывод, что содержание аммиака как конечного продукта катаболизма белков в тканях и крови может быть использовано в качестве одного из чувствительных биохимических показателей реакции рыб на токсические воздействия. Опыты показали также, что нарушение процессов детоксикации аммиака в головном мозге, ведущее к увеличению его содержания в центральной нервной системе рыб, является одним из важных биохимических механизмов патологических изменений при токсикозах рыб.

Аминокислоты. Развитие этих исследований привело к необходимости изучить еще один показатель интенсивности и направленности белкового обмена в организме рыб, подвергающихся токсическому воздействию. Мы имеем в виду аминокислоты — основные структурные элементы белков, динамику их содержания в различных органах и тканях. Первые сведения по этому вопросу стали появляться в начале 70-х годов. Увеличение содержания одиннадцати свободных аминокислот, в том числе двух дикарбоновых (глютаминовой и аспарагиновой), участвующих в детоксикации аммиака, отмечено в крови радужной форели, отравленной диэлдрином [706]. Аналогичный эффект оказывал и другой хлорорганический пестицид — ДДТ.

Обстоятельное изучение фонда свободных и связанных аминокислот в различных органах и тканях двух видов рыб (окунь и язь) выполнено А. Я. Малярсвской с сотрудниками [207]. Токсическое действие на рыб разложившихся сипезеленых водорослей приводит к изменению количества свободных аминокислот, направленность и выраженность которого определяется видовыми особенностями исследованных рыб: снижается у окуня и повышается у язя. Наиболее значительное увеличение общей суммы аминокислот отмечено у язя в печени (на 237%); суммарное содержание заменимых аминокислот возросло в печени отравленных язей

на 434 % в основном за счет повышения количества глутаминовой кислоты с треонином и тирозина. Общее содержание незаменимых аминокислот в печени также увеличилось, однако в значительно меньшей степени (всего лишь на 40%), чем количество заменимых. Столь резкие изменения общего фонда свободных аминокислот

впечени — основном органе синтеза белка и детоксикации чужеродных веществ — вполне объяснимы. На основе полученных данных авторы приходят к выводу, что обнаруженные ими изменения аминокислотного состава отражают нарушение процесса синтеза белка у рыб под влиянием синезеленых водорослей.

Аминокислотный состав мышц оказался значительно более стабильным, и отмеченные здесь изменения резко уступали изменениям, имевшим место в печени.

Так, общая сумма свободных аминокислот в мышцах отравленных язей увеличилась на 65% против 237%

впечени, а суммарное содержание незаменимых аминокислот (за исключением лизина) вообще осталось без изменений [207]. Сходные результаты получены в 60-суточных опытах на трехлетних карпах, подвергшихся токсическому воздействию сырой нефти в концентрации 0,5 мл/л [304]. Общее содержание свободных и связанных аминокислот в мышцах рыб оставалось практически без изменений в течение всего опыта. Количество отдельных свободных аминокислот претерпевало незначительные и к тому же разнонаправленные изменения: содержание метионина и лизина увеличивалось, глицина, валина и гистидина — снижалось, аргинина, алапина и серина — не претерпевало сколько-нибудь выраженных изменений. В другой серии опытов, выполненных на двухлетних карпах с сырой нефтью концентрацией 0,05 мг/л, к концу 2-месячных наблюдений содержание свободного лизина, серина, аспарагиновойЧ-глютаминовой аминокислот в мышцах у подопытных рыб выше, а связанных аминокислот (этих же) на 7-20% ниже, чем у контрольных [94]. Значительно более выраженное увеличение суммы свободных аминокислот (36,7-73,4%) отмечено в сыворотке крови двухлетних карпов под влиянием повышенных концентраций углекислоты в воде при постоянном значении рН [89].

Анализируя пока еще немногочисленные данные по изменению количества свободных и связанных аминокислот в различных органах и тканях рыб под влиянием токсикантов, необходимо отметить следующее. В процессе интоксикации рыб суммарное содержание свободных аминокислот увеличивается в крови [706, 89], печени [207], головном мозге [707], кишечнике и мышцах [207], причем в мышцах эти изменения менее выражены и подчас разнонаправленнее, чем в других органах. Колебания аминокислотного состава органов и тканей отравленных рыб могут вызываться разными причинами, в том числе угнетением синтеза белка, нарушением трансаминирования, дезаминироваиия и декарбоксилирования, и, наконец, усилением распада белков, ведущего к увеличению суммарного содержания свободных аминокислот.

Особое внимание исследователей привлекает динамика изменений отдельных групп аминокислот, в частности дикарбоновых, а среди них глютаминовой кислоты — связующего звена белкового, углеводного и липидното обмена. Глютаминовая кислота является важнейшим элементом промежуточного обмена аминокислот, осуществляемого путем трансаминирования и оксидативного дезамииирования.

Трансаминирование (переаминирование) — обратимая реакция переноса аминогруппы между аминокислотами и кетокислотами, в результате которой образуются глютаминовая кислота и кетокислота, соответствующая исходной аминокислоте. Ферменты, катализирующие реакции трансаминирования, называются трансаминазами. Хотя все природные аминокислоты подвергаются ферментативному трансаминированию, однако с наибольшей интенсивностью эта реакция протекает между глютаминовой и щавелевоуксусной кислотами — катализируется аспартатрансамипазой (ACT), а также между глютаминовой кислотой и пировиноградной кислотой — катализируется аланинтрансами-назой (АЛТ). Простетической группой (кофермептом) трансаминаз является пиридоксальфосфат, представляющий собой 5-фосфатный эстер витамина В6.

Образующаяся в результате трансаминирования различных аминокислот глютаминовая кислота подвергается оксидативному (окислительному) дезаминированию, конечные продукты которого — кетоглютаровая кислота и аммиак. Реакция эта обратима и катализируется глютаматдегидрогеназой. Существует мнение, что глю-таматдегидрогеназа играет решающую роль в оксидативном дезаминировании большинства других аминокислот после их предварительного переамииирования [90]. Коферментом глютаматдегидрогеназы служит никотинамидадениндииуклеотид (НАД) или никотинамид-адениндинуклеотидфосфат (НАДФ).

Учитывая важнейшую роль реакций трансаминирования и оксидативного дезаминирования в обеспечении нормального хода белкового обмена, в клинической биохимии для диагностических целей уже давно и успешно используют активность ферментов, катализирующих эти реакции. В ихтиотоксикологии они стали применяться недавно, но результаты опытов обнадеживают. Первые сведения о наличии у рыб трансаминаз появились в конце 60-х и начале 70-х годов [443, 722, 485, 606, .765].

В основополагающей работе Г. Белла [443], выполненной на тихоокеанском лососе, показано, что под влиянием гепатотропных ядов, таких, как бромбензол, четыреххлористый углерод, в крови рыб изменяется активность глютаматпируваттрансаминазы, и эти изменения могут быть использованы в диагностических целях.

Ингибирование активности аспартаттрансаминазы ртутью, мышьяком, шестивалентным хромом, оловом и магнием отмечено у одного из видов чукучановых рыб (Catostomus commersoni). Медь и трехвалентный хром не оказывали влияния на этот фермент, а кобальт, цинк, свинец и железо обладали слабовыраженным ингибирующим эффектом [485]. Трансаминазная активность сыворотки крови карпа менялась под влиянием двух фосфорорганических пестицидов: ДДВФ и диптерекса [765]. Снижение активности глютаматпируваттрансаминазы обнаружено у речного угря (Anguilla anguilla), отравленного пентахлорфенолом [606]. Длительное голодание угрей приводило к двукратному увеличению активности глутаматоксиацетаттраисаминазы в печени [657], а скармливание радужной форели циклопропеноидиой кислоты

— к снижению активности аланинтрансаминазы в этом органе [688].

Выраженные, но разнонаправленные изменения активности трансаминаз выявлены в различных органах язей, отравленных токсическими продуктами синезеленых водорослей [206]. Активность аспартаттрансаминазы достоверно увеличилась в сердце и мозге (на 71,1 и 39,6% соответственно), снизилась в кишечнике (на 47,9%) и осталась практически без изменений в печени и мышцах, резко различающихся между собой по метаболической активности. По иному меняется активность алаиинтрансаминазы у этих же рыб: в сердце и кишечнике достоверно возросла (на 113,8 и 45,6% соответственно), в печени и мозге достоверно снизилась (на 39,7 и 23,9%), в мышцах не изменилась. Автор считает, что выявленные изменения свидетельствуют о нарушении синтеза белка, развивающегося у рыб под воздействием синезеленых водорослей и их токсинов. Вероятно, что это неспецифические нарушения, возникающие у отравленных рыб; они носят вторичный характер и отражают различную степень развития далеко зашедшего токсического процесса, вызванного синезелеными водорослями.

Таким образом, изменение активности трансаминаз (угнетение или повышение) проявляется у многих видов рыб под влиянием различных токсикантов, что свидетельствует о возможности использования этого биохимического показателя обмена белков в диагностических целях. Другой фермент промежуточного обмена аминокислот — глютаматдегидрогеназа, катализирующая оксидативное дезаминирование аминокислот и в первую очередь глютаминовой кислоты, все еще не привлек должного внимания исследователей. Между тем в литературе имеются сведения [707] о том, что отравление рыб некоторыми пестицидами (диелдрином) снижает активность глютаматдегидрогеназы в мозге и увеличивает ее активность в печени. Авторы придают большое значение этому факту и считают, что в основе токсического действия диелдрина, вызывающего повышение концентрации аммиака в мозге, лежит угнетение активности глютаматдегидрогеназы. Гипотеза эта заслуживает внимания и нуждается в дальнейшем экспериментальком обосновании с использованием других токсикантов, отравление которыми приводит к развитию аминотоксикоза мозга рыб.

Завершая анализ фактических данных, характеризующих влияние токсикантов на белковый обмен в органах и тканях рыб, остановимся еще на одной серии работ, посвященных обоснованию возможности использования коллагена и гидроксипролина в токсикологических исследованиях на рыбах [708, 696, 697, 698, 200, 402]. Коллаген относится к группе протеинодов (белковоподобных веществ) и является основным органическим компонентом, структурной основой опорных тканей, таких, как соединительная, хрящевая и костная. Чрезвычайно своеобразен аминокислотный состав коллагена. В молекулу коллагена наряду с аминокислотами входят иминокислоты, содержащие иминогруппу NH, а не аминогруппу NH2, как все аминокислоты. Это гидроксипролин и гидроксилизин, которые в белках не обнаружены. Обе иминокислоты в свободном виде не встречаются и образуются внутри уже построенного коллагена (точнее, его предшественника

— протоколлагена) путем окисления пролинового и лизинового радикалов.

Исследованиями американских токсикологов установлено, что содержание гидроксипролина и коллагена позвоночника, являясь чувствительным индикатором роста, снижается у рыб, подвергнутых длительному токсическому влиянию сублетальных концентраций токсафена и ароклора. Это происходит значительно раньше, чем удается обнаружить снижение темпа роста. Так, отравление токсафеном приводит к замедлению темпа роста ручьевой форели, через 3-4 нед после снижения содержания гидроксипролина.

В опытах на толстоголовом гольяне (Pimephales promelas) показано, что количество гидроксипролина в коллагене позвоночника достоверно снижается при концентрациях токсафена, в 2-3 раза меньших, чем концентрации, вызывающие замедление роста. Примерно сходные по выраженности данные были получены и в опытах с мальками сомика (Ictalurus punctatus). Снижение концентрации гидроксипролина ведет к замедлению синтеза коллагена и повышению минерализации позвоночника, что внешне проявляется в симптоме «сломанная спина» [200, 402]. Правда, в опытах с некоторыми токсикантами (в частности, с 2,4-Д) концентрация гидроксипролина существенно не меняется, а содержание коллагена достоверно снижается, на основании этого авторы справедливо считают, что для «облегчения интепретации токсикологических результатов следует измерять, если это возможно, и гидроксипролин, и коллаген позвоночника» [200, с. 313].

Из представленных в этом разделе данных можно сделать вывод, что многие токсические вещества вызывают существенное нарушение нормального хода белкового метаболизма у рыб. В связи с этим ряд показателей белкового обмена (концентрация общих сывороточных и тканевых белков, содержание свободного аммиака в тканях, фонд свободных аминокислот и активность ферментов, контролирующих обмен аминокислот) могут быть использованы для прогнозирования исхода токсического процесса и оценки степени токсичности веществ с выраженным гепатотроиным действием.

Углеводный обмен

Одним из двух основных источников энергии, необходимой организму для обеспечения разнообразных процессов жизнедеятельности, являются углеводы. Глюкоза и гликоген — легко мобилизуемые энергетические субстраты, используемые организмом в качестве «запального» топлива для обеспечения энергией многих физиологических процессов, лежащих в основе реакций на экстремальные условия. В связи с этим показатели углеводного обмена, его интенсивности и направленности представляют первостепенный интерес при оценке реакции рыб на токсические вещества. Об этом свидетельствуют теперь уже многочисленные экспериментальные данные, полученные в опытах на разных видах рыб, подвергнутых токсическому воздействию ядов органического и неорганического ряда.

Первые опыты в этом плане выполнены нами [184] около 20 лет тому назад, их результаты были доложены на Всесоюзном совещании по экологической физиологии в январе 1966 г. Эксперименты проводились на лещах и налимах с концентрацией фенола 5 мг/л. Условия постановки опытов и схема взятия проб крови у рыб описаны в предыдущем разделе этой главы. Содержание сахара в крови определяли по методике Хагедорна и Иенсена, используя для осаждения белка гидрат окиси цинка, наиболее полно удаляющий вместе с белками несбраживаемые редуцирующие вещества. Результаты подвергали статистическому аиализу с помощью непараметрического критерия Вилкоксона.

Содержание налимов в растворе фенола концентрацией 5 мг/л уже в течение первых 24 ч приводит к небольшому, но хорошо заметному подъему уровня сахара в крови, среднее значение которого у подопытных рыб достигало 100 мг% против 73 мг% у контрольных. При этом следует отметить наличие индивидуальных особенностей реактивности налимов, подвергнутых токсическому воздействию фенола. Так, у 27% подопытных налимов отмечена ярко выраженная гипергликсмия при среднем содержании сахара 218 мг%, что в 3 раза превосходит этот показатель у контрольных рыб. У подопытных рыб второй группы (30% особей) имела место гипогликемия при среднем содержании сахара 42,2 мг%. Наконец, у подопытных налимов третьей группы (43% особей) содержание сахара практически оставалось неизменным в сравнении с его количеством у контрольных групп налимов. Если учесть, что все налимы, как подопытные, так и контрольные, длительное время (в течение зимнего периода) содержались в аквариальных условиях, то обнаруженные нами разнонаправленные сдвиги уровня сахара в крови подопытных рыб можно увязать с различной индивидуальной устойчивостью налимов к токсическому действию сублеталыюй концентрации фенола.

Через 48 ч после погружения рыб в токсический раствор наметилась тенденция к некоторому снижению содержания сахара в крови подопытных налимов (92 мг%) и его нормализации, наблюдавшаяся последующие 2 сут. Во всяком случае через 96 ч после начала опытов уровень сахара в крови подопытных и контрольных налимов оказался одинаковым (по 73 мг%). Однако на 5-е сутки контакта рыб с ядом содержание сахара в крови вновь поднялось у подопытных налимов до 94 мг%. Иными словами, у подопытных рыб имеет место 2-фазовое изменение уровня гликемии: первоначальное повышение, затем возвращение к норме и относительная * стабилизация и новое повышение в случае продолжающегося контакта рыб с ядом.

Выраженная гипергликемия отмечена нами и в опытах с лещами. Подопытные рыбы, выдержанные в растворе фенола концентрацией 5 мг/л в течение 96—144 ч, имели значительно более высокий уровень содержания сахара в крови (66 мг%), чем контрольные (45 мг%). Сопоставляя особенности изменений углеводного обмена у двух исследованных видов рыб, различающихся образом жизни и уровнем двигательной активности, необходимо отметить, что изменение уровня сахара в крови у лещей более выраженное и стойкое, чем у налимов. У активных лешей сублетальная концентрация фенола вызывала более высокую, чем у налимов, двигательную активность, а следовательно, повышенную потребность мышц в глюкозе. Это в свою очередь приводит, по-видимому, к более энергичной мобилизации гликогена, поступлению глюкозы в кровяное русло с последующей доставкой в мышцы, которые за счет ее окисления покрывают свои энергетические потребности.

Предположение о повышенной мобилизации гликогена в печени было проверено в нашей лаборатории Г. К. Шелухипым на модели нестицидного отравления 4-месячной молоди русского осетра. Опыты ставили в 70литровых аквариумах. Токсические растворы аэрировали и меняли один раз в сутки. В качестве токсикантов использовали метафос концентрацией 8,3 мг/л, пропанид (13,3 мг/л) и ялан (25 мг/л).

Определение гликогена в печени производили антроиовым методом на 5-е сутки с начала опытов.

Резкое, почти четырехкратное снижение количества гликогена в печени отмечено у молоди русского осетра, отравленной мстафо-сом: 1,00±0,29 г% в опыте и 4,71 ±1,07 г% в контроле. Менее выраженное, но достаточно заметное (на 24%) снижение содержания гликогена в печени отмечалось и в опытах с пропанидом: с 4,71±1,07 г% у контрольных до 3,58±1",09 г % у подопытных рыб; и только ялан в течение 5-суточного опыта не оказал существенного влияния па содержание гликогена в печени осетра.

Полученные нами исходные данные по влиянию некоторых токсикантов органической природы на углеводный обмен рыб свидетельствовали о возможности использования важнейших показателей этого обмена (содержания сахара в крови и гликогена в печени) в качестве биохимических индикаторов токсического эффекта.

Последующие работы, выполненные как в нашей стране, так и за рубежом на разных видах рыб с различными группами токсикантов, подтвердили как сам факт изменения углеводного обмена у отравленных рыб, так и его диагностическое значение [783, 844, 545].

Так, В. В. Метелсв [228] провел сравнительное изучение концентрации сахара в крови и гликогена в печени у карпов, подвергнутых токсическому воздействию фтористого натрия, метилнитрофоса и фосфамида. Через 24 ч после погружения карпов в раствор фтористого натрия сублетальной концентрации (350 мг/л) у них отмечена гипергликемия. Однако, как и в наших опытах с налимами, выраженность наступивших изменений в содержании сахара и даже их направленность оказались неодинаковыми у разных групп карпов. Например, содержание сахара в крови у подопытных рыб первой группы (4 особи) (103,7±15,2 мг%) оказалось почти в два раза выше, чем у контрольных (62,1 + 10 мг%). У подопытных карпов второй группы (4 особи) произошло снижение (97,1 ±26,0 мг%) содержания сахара в крови на 24% в сравнении с его количеством у контрольных рыб (127±29,5 мг%). Наконец, у подопытных карпов третьей группы (4 особи) имела место незначительная гипертликемия — увеличение содержания сахара в крови всего на 17% (99,4±7,2 мг% у контрольных и 117,8±2,2 мг% у подопытных). Привлекает внимание чрезвычайно широкая амплитуда колебаний среднего уровня содержания сахара в крови у контрольных карпов: от 62,1 ±10 до 127±29,5 мг%. Возможно, оно отражает недостаточную