5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Респираторная_медицина_Руководство_Том_2,_Чучалин

либо клетками с признаками атипии, выражающимися в полиморфизме размеров и формы клеток и ядер, появлением сосочковых, слоистых структур с наслаиванием клеток — в случае пролиферации клеток с признаками атипии. При иммуногистохимическом исследовании в очагах, содержащих овальные и щелевидные структуры, обнаруживаются митозы и продукция Ki-67 и PCNA, увеличивающаяся при нарастании признаков клеточной атипии [14, 18].

Изучались также овальные структуры с признаками атрофии клеток, когда клетки, выстилающие овальные и щелевидные полости, были уменьшены в размерах, уплощены и похожи на базальные клетки. В этих участках отмечалось накопление продуктов экспрессии PCNА, Ki-67, c-myc, b-TGF и в небольших количествах — р53. Сравнивая цитогенетические варианты дисрегенераторных изменений легочного эпителия в бронхиолах и альвеолах, следует отметить наличие более широкого спектра дисрегенераторных изменений на периферии легкого, что говорит о большей пластичности и разнообразии прогениторных клеток в этой области. Не исключено также, что эта пластичность связана с особым микроокружением периферических отделов легкого, особенно

вусловиях хронического воспаления, накопления эмбриональных типов коллагена.

Всвете последних данных о возможности имплантации мезенхимальной костномозговой клет- ки-предшественницы и ее дифференцировки в клетки легочного эпителия именно на периферии легкого имеются наиболее благоприятные условия для ее выживания: обилие капиллярного кровотока и особенности экстрацеллюлярного матрикса.

Диффузная идиопатическая гиперплазия нейроэндокринных клеток легкого. Синдром диффузной идиопатической гиперплазии нейроэндокринных клеток выделен в 2004 г., вероятно, обусловлен генетической предрасположенностью в связи с аллельным дисбалансом в регионе 11q13. В классификации ВОЗ он отмечается как предопухолевый процесс, который может привести к развитию карциноидов и нейроэндокринных карцином легкого. Характеризуется развитием различных вариантов гиперплазии легочного нейроэпителия

ввиде диффузной пролиферации в бронхах, в строме с формированием так называемых нейроэндокринных телец, опухолей и карциноидов. Часто сочетается с легочным фиброзом, но других патологических процессов, которые могли бы привести к вторичной гиперплазии нейроэндокринных клеток, не выявляется. Нейроэндокринная гиперплазия на светооптическом уровне с трудом отличается от базально-клеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии (рис. 10.34, 10.35). Отличительным признаком является наличие в эпителиальном пласте клеток округлой и овальной формы со светлой цитоплазмой и крупными овальными ядрами, при этом в клетках иммуно-

гистохимически выявляются маркеры нейроэндокринной дифференцировки — хромогранин-А, синаптофизин, нейрон специфическая енолаза и др. Ki-67-положительные клетки располагаются в базальных и парабазальных зонах, то есть цитогенетически, вероятнее всего, связаны с клетками Кульчицкого бронхиальной стенки [18].

Рис. 10.34. Гиперплазия нейроэндокринных клеток. Хромогранин А в нейроэндокринных клетках в пласте бронхиального эпителия. Иммунопероксидазная реакция. ×200

Рис. 10.35. Гиперплазия нейроэндокринных клеток. Нейроэпителий с нейроэндокринными гранулами в цитоплазме. Электронограмма. ×10 000

иучаствует в Notch сигнальном пути. АLDH 1 отвечает за пролиферацию, самообновление и туморогенность РСК. Связан с плохим прогнозом НМРЛ [56].

СD133 как маркер РСК обнаружен в глиобластомах [38], раке толстой кишки [87], поджелудочной железы [84]. Установлено, что в образцах НМРЛ и МРЛ СD133+ опухолевые клетки обладают туморогенностью и способностью к самообновлению [89]. Однако показано, что и СD133-опухолевые клетки РЛ могут обладать туморогенностью с образованием ксенографта при их пересадке мышам, а также способностью к самообновлению [143]. Кроме того, экспрессия опухолевыми клетками СD133 не коррелирует с прогнозом [60, 95, 116]. Nоrashikin Zakaria и соавт. [98] исследовали РСК в культурах НМРЛА 549

иН2170 и обнаружили два типа РСК: CD166+/ CD44+ и CD166+/EpCAM+ (табл. 10.5).

Авторы обнаружили активацию и дисрегуляцию сигнальных путей. Во-первых, это ключевые пути, связанные с биологией самих РСК, во-вто-

рых, сигнальный путь, определяющий нарушение образования ламинина и интегринов экстрацеллюлярного матрикса, являющихся компонентами ниши стволовых клеток [52, 85, 116, 149]. В РСК РЛ были активированы Wnt и Hedghog сигнальные пути, характерные для неопухолевых стволовых клеток и связанные с множественной лекарственной устойчивостью РЛ [35, 105].

Эмбриональные сигнальные пути в раковой стволовой клетке рака легкого

Эмбриональные сигнальные пути являются основой органогенеза.

Ктаким путям относятся:

1)Hedgehog;

2)Notch;

3)Wnt;

4)b lymphoma MLV insertion region;

5)в РСКРЛ имеются нарушения этих путей [129]. Имеются агенты, способные блокировать эти пути, что уже включено в терапевтическую стратегию лечения рака (табл. 10.6).

Hedgehog сигнальный путь участвует в регуляции пролиферации, миграции и дифференцировки прогениторных клеток [118] и не работает в большинстве нормальных тканей. Активирован в РЛ [150]. В МРЛ был впервые продемонстрирован

в2003 г. [144] и считается характерным для РСК с нейроэндокринной дифференцировкой.

Блокирование Hedgehog сигнального пути лекарственными препаратами (Veratrumal kaloid cyclopamine, LDE-225) снимает туморогенность [144] МРЛ и предотвращает рецидивы [102].

Notch сигнальный путь — консервативный путь, определяющий судьбу клетки и способность стволовых клеток к асимметричному делению [31]. Участвует в эмбриогенезе легкого, образовании проксимальных и дистальных отделов легкого. На мышах показано, что его блокирование усиливает нейроэндокринную дифференцировку [43, 71], а также приводит к концентрации стволовых клеток

вдистальных отделах легкого [48].

Вкультурах НМРЛ повышена активность пути [37, 100]. Поддерживает про-апоптотические сигналы и ингибирует антиапоптотические сигналы

спомощью сурвинина [37, 78]. Активирован в ALDH+ клетках НМРЛ [127].

Таргетная терапия на стадии разработки. Блокирование пути путем ингибирования гамма-секре- тазы приводит к остановке роста и активизации апоптоза клеток РЛ как in vivo, так и in vitro [78]. Особенно интересно, что дисрегуляции Notch сиг-

нального пути обнаруживается в Ras-ассоциирован- ном РЛ [145]. Блокада вызывает антиангиогенное действие и воздействует на иммунную резистентность [103, 106].

МРЛ не поддается лечению, вероятно, с редкой экспрессией в его клетках Notch рецепторов.

Wnt/betta-catenin сигнальный путь:

•участвует в туморогенезе РЛ [139];

•таргетная терапия с моноклональными антителами индуцирует апоптоз в клеточных линиях РЛ, продуцирующих Wnt-2 протеин [151].

Концепция РСК имеет несколько важных приложений. Наиболее важным является то, что если РСК обеспечивают персистирование опухоли, то именно эти клетки должны быть элиминированы при лечении онкологического больного. Выдвигается гипотеза: так же как и нормальные стволовые клетки, РСК обладают высокой внутренней резистентностью к стандартной терапии, поскольку отличаются низкой митотической активностью и содержат фактор множественной лекарственной устойчивости-1, препятствующий действию химиотерапевтических препаратов [6, 76].

Следовательно, ограниченный успех современных методов терапии можно связать с невозможностью уничтожить РСК, которые являются источником опухоли.

Однако в настоящее время имеются подходы к возможности воздействия на: полагают о возможности ее созревания и дифференцировки в зрелые клетки, уничтожения или уничтожения через блокирование ее сигнальных путей. Первые попытки такого воздействия через ингибирование эмбриональных сигнальных путей в РЛ приведены в табл. 10.7.

Концепция развития РЛ заключается в том, что первоначально предраковые изменения и РЛ возникают в области ниш тканевых стволовых клеток, где имеется воздействие канцерогенных агентов, с накоплением мутаций с последующей пролиферацией прогениторных клеток и их злокачественной трансформацией и развитием рака. Не исключается также и такая последовательность событий, когда трансформированные пролиферирующие клетки претерпевают перепрограммирование и из них образуется РКС (рис. 10.36).

Молекулярные механизмы канцерогенеза рака легких (геномика, протеомика и эпигенетика)

Молекулярные механизмы канцерогенеза рака легких связаны с перестройками генома, протеома, метаболома трансформированных клеток, а также с эпигенетическими нарушениями, которыми занимаются геномика, протеомика, метаболомика и эпигенетика.

Геномные перестройки при раке легкого

Молекулярные основы канцерогенеза базируются на открытии того факта, что развитие опухолей является результатом возникновения множественных мутаций в стволовых клетках, происходящих при повреждении молекул ДНК, которые, в свою очередь, могут быть следствием генетической нестабильности и хромосомных аберраций, а также возникать вследствие эпигенетических изменений.

В большинстве случаев РЛ такие мутации развиваются в тканевых стволовых клетках, однако при наследственных и семейных формах рака определенные мутации могут передаваться и через герминативные клетки. Это заключение подтверждается четырьмя группами фактов:

1)наличием корреляций определенных хромосомных мутаций с некоторыми типами опухолей;

2)развитием опухолевого фенотипа в клетках при трансфекции в них онкогеннных вирусов;

3)обнаружением мутагенных свойств у большинства известных канцерогенных агентов;

4)эпигенетическими перестройками в опухолевых клетках.

204

Рассматривая различные теории этиологии опухолей, поражаешься тому факту, что разнообразные канцерогенные агенты, отличающиеся по механизмам своего действия, приводят к одному и тому же результату — развитию опухолей (рис. 10.37).

При этом четыре класса генов являются важнейшими мишенями канцерогенных агентов:

•протоонкогены, регуляторы пролиферации и дифференцировки клеток;

•гены-супрессоры опухолей (антионкогены), ингибирующие пролиферацию клеток;

•гены, участвующие в гибели клеток путем апоптоза;

•гены, отвечающие за репарацию ДНК.

Клеточные онкогены при раке легкого

Доминирующие онкогенов, которые часто участвуют в раке легких, включают С-Мус, KRAS, EGFR, C-MET и С-KIT.

KRAS-мутации в настоящее время считаются одним из ключевых таргетным геном при лечении НМРЛ. Мутации наиболее часто встречаются в РЛ, особенно в аденокарциномах, где они обнаруживаются в 30% случаев [18, 68]. Выдвигается гипотеза о том, что KRAS-мутации являются также маркерами атипической железистой гиперплазии (варианта железистого предрака) и аденокарцином, что подтверждается при исследовании РЛ человека и в эксперименте на трансгенных мышах [18, 97].

Семейство RAS клеточных онкогенов нередко подвергается изменениям при опухолевом росте. Выявляется иммуногистохимическими методами чаще при предраковых аденоматозах (рис. 10.38) и аденокарциномах легкого [18]. Гены кодируют синтез белков р21, обладающих гуанозинтрифосфатазной активностью, связывающихся с гуано-

зинтрифосфатом и тем самым воздействующих на передачу ростового сигнала в клетке. Описаны мутации, активирующие ras-гены и локализующиеся в 12-м, 13-м и 61-м кодонах.

Наиболее часто в раке легкого обнаруживаются мутации KRAS, присущие только немелкоклеточному РЛ, в отличие от МРЛ [111, 112, 131]. Мутации KRAS могут приводить к активации нескольких сигнальных путей. Ras-онкопротеин активирует сигнальный путь RAF/MEK/extracellular signal-regulated kinase, стимулирующий клеточный рост путем вхождения клеток в митотический цикл через фосфорилирование транскрипционных факторов (например, таких как c-FOS, ELK1, andMYC); фосфорилирование киназ ribosomal protein S6 kinase и mitogen-activated proteinkinase, а также phosphatidyl inositol-3-kinase/proteinkinase B сигнального пути, контролирующих жизнеспособность, рост и метаболизм клетки [107, 119]. Мутантный KRAS может вызвать трансформа-

Рис. 10.38. Экспрессия ras в клетках атипической аденоматозной гиперплазии. Иммунопероксидазная реакция. ×400

цию клетки путем активации extracellular signalregulated kinase-mitogen-activated protein kinase and phosphatidyl inositol-3-kinase/proteinkinase B сигнальных путей [76]. Частота мутаций KRAS в аденокарциномах легкого составляет до 30%, а в плоскоклеточном РЛ только 3%. В двух больших исследованиях 30% случаев аденокарцином имели мутации в кодоне 12 и только 3% в других кодонах. Показана связь KRAS-мутаций с табакокурением [131]. О влиянии на выживаемость больных РЛ данные противоречивы: ранее была показана взаимосвязь мутации в KRAS, не подтвержденная в более поздних работах [107, 117].

KRAS-мутации обнаружены при предраке легкого — атипической гиперплазии альвеолярного эпителия в 40% случаев в окружающей легочной ткани вокруг аденокарцином, в которых мутации соответственно были найдены в 39% полимераз- ноцепной-аллельспецифической гибридизации. В этих же очагах описана экспрессиия р53. Найдены корреляции более высокой экспрессии данного онкопротеина с железистой дифференцировкой РЛ. Высокая экспрессия белковых продуктов ras регистрировалась нами также в очагах аденоматоза легкого и в овальных и щелевидных эпителиальных структурах в рубцах (Коган). Выдвигается гипотеза о том, что KRAS-мутации являются маркерами атипической железистой гиперплазии (варианта железистого предрака) и аденокарцином, что подтверждается при исследовании РЛ не только человека, но и в эксперименте на трансгенных мышах [18].

Поскольку RAS часто мутирует в раковых опухолях человека, естественно, было предпринято множество попыток создать анти-RAS-методы таргетной терапии. К сожалению, эффективность при использовании в клинической практике ни одного из этих методов не была доказана [53, 90, 112].

Семейство myc клеточных онкогенов — c-myc, L-myc, N-myc — немедленно реагирующие гены, кодирующие клеточные регуляторные белки, индуцирующие пролиферацию и подавляющие дифференцировку. Установлено, что в отсутствие факторов роста повышение экспрессии c-myc приводит не к делению клеток, а к апоптозу, который может ингибироваться bcl-2. C-myc амплификация обнаруживается в 10–25% случаев РЛ, в то время как L-myc и N-myc — только в нейроэндокринных опухолях легких (10–30%). Определение повышенной экспрессии myc онкопротенинов регистрируется значительно чаще по матричной. Определение же повышенной экспрессии иммуногистохимически затруднено, поскольку белковые продукты обладают очень коротким периодом жизни. Полупериод распада составляет 10 мин.

Экспрессия L-myc обнаруживалась только в группе нейроэндокринных опухолей легких, а экспрессия с-myc — как в группе мелкоклеточного, так и немелоклеточного РЛ. В группе мелкоклеточного РЛ установлена достоверная корреляция

экспрессии L-myc и c-myc с наличием метастазов и размерами опухоли [18, 97].

Семейство bcl-2, состоящее из bcl-2, bax, bak, bclXL, bclXS, — белковые продукты которых способны образовывать гомо- и гетеродимеры, оказывающие порой диаметрально противоположное действие на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Наиболее изученный из данного семейства bcl-2 локализуется на внутренней мембране митохондрий, а также в ядре, стимулирует пролиферацию клеток и ингибирует апоптоз, вероятно, за счет антиоксидантной активности. Напротив, bax-протеины, транскрипция и синтез которых регулируется р53, блокируют пролиферацию и стимулируют апоптоз опухолевых клеток. BclXL ингибирует апоптоз и стимулирует пролиферацию, а bclXS — напротив, индуцирует апоптоз. Таким образом, баланс между белковыми продуктами bcl-2-bax, bclXL-bclXS будут определять сдвиг равновесия в сторону пролиферации или апоптоза в опухоли [18, 97].

Особое внимание следует обратить на ядерную локализацию онкопротеина, так как, по данным литературы, она может соответствовать его неактивной, фосфорилированной форме, не способной блокировать апоптоз. Обнаружена также достоверная корреляция между экспрессией bcl-2 и стадией опухоли. В то же время при исследовании корреляции между экспрессией bcl-2 и выживаемостью больных МРЛ нами была получена положительная корреляция между экспрессией bcl-2 и лучшими показателями выживаемости больных. Полученные противоречия являются, по всей видимости, неслучайными и могут быть связаны с несколькими факторами. Во-первых, не исключено, что bcl-2 положительные мелкоклеточные карциномы более чувствительны к проводимой химиотерапии; во-вторых, выживаемость больных определяется множеством других показателей, например уровнем активности систем, обеспечивающих антибластомную резистентность, общую резистентность организма и др.; и, наконец, известно, что дисбаланс bcl-2 c другими членами семейства bcl-2, прежде всего bax, определяет прогноз при МРЛ.

При НМРЛ остаются сомнительными корреляции экспрессии bcl-2 с выживаемостью больных, данные противоречивы. В целом можно сделать вывод, что иммуногистохимия bcl-2 и bax имеет колоссальное значение в определении прогноза при РЛ.

Гены-супрессоры при раке легкого

Делеции или инактивация генов-супрессоров опухолей охватывают p53, p16, RB1 (Ink4a), а также множество локусов на хромосоме 3p. В этих участках локализуются другие многочисленные гены-супрессоры опухолей, кандидаты для участия в канцерогенезе, такие как FHIT, RASSF1A и др., которые еще предстоит идентифицировать.

ет как клеточный онкоген, стимулирует пролиферацию опухолевых клеток и вызывает образование антител, которые выявляются в крови больных. Последнее послужило основанием для разработки иммунодиагностики и иммунотерапии РЛ [132].

Мутация вызывает конформационные изменения в протеине р53 и он накапливается в ядрах клеток, что позволяет определять его иммуногистохимическими методами. Напротив, считается, что дикий тип р53 обладает очень коротким полупериодом жизни (20 мин) и поэтому его невозможно определить иммуногистохимически. Накопление мутантного р53 обнаруживается в 70–100% случаев культуры клеток МРЛ, 50–70% МРЛ операционного и секционного материала и 45–75% НМРЛ. р53-аккумуляция в ядрах клеток может достоверно свидетельствовать о появлении мутации в гене, при условии, что имеется не менее 20% позитивных клеток, выявленных не менее чем 2 методами. р53 негативные случаи — это не только случаи с диким типом р53, но и с отсутствием синтеза какого-либо белка р53. Эти случаи могут иметь также и не определяемые и сплайсинговые мутации, которые невозможно выявить иммуногистохимически, составляющие примерно 20% негативных по р53 случаев. В целом инактивация р53 при раке легкого имеется примерно в 70% случаев [18]. Исследования по корреляции экспрессии р53 с выживаемостью противоречивы. В целом если такое действие и есть, то оно очень несущественно. Непонятна и связь р53 со злокачественной трансформацией. В то же время экспериментальные данные показывают, что при активации дикого типа р53 происходит замедление роста и развивается апоптоз, что может привести к реверсии злокачественного фенотипа.

Имеются доказательства о значении мутации р53 на ранних стадиях канцерогенеза легкого. Так, например, мутации Tр53 могут развиваться за счет полициклических углеводородов и обнаруживаться у курильщиков [68]. р53 мутантные формы никогда не выявляются при резервной базально-клеточной гиперплазии или плоскоклеточной метаплазии без признаков дисплазии. При дисплазии р53-мута- ции выявляются в 12–53% случаев, а при раке на месте — в 60–90% случаев в исследованиях ткани, окружающей РЛ [18]. В соответствии с результатами последних исследований ожидаемая частота экспрессии р53 при дисплазиях эпителия легкого составляет до 91%. Взаимосвязь накопления р53 при предраке с последующим развитием опухоли достоверна (р=0,0014). Обнаружение р53 более чем в 20% клеток в очагах дисплазии является маркером необратимых предраковых изменений. Однако следует помнить, что примерно 50% случаев РЛ развивается без р53-мутации. Следовательно, р53-мутация — это необязательный феномен, характерный для РЛ, и поэтому отсутствие р53 не является благоприятным прогностическим фактором. Кроме того, ни накопление р53, ни его мутации

не исчерпывают молекулярные механизмы, через которые р53 может инактивироваться в опухолях. Было установлено, что белковый продукт р53 выявлен в ядрах раковых клеток в 47% наблюдений. При этом частота экспрессии р53 в МРЛ составила 67%, а в НМРЛ — 46%. Найдена достоверная корреляция между уровнем экспрессии р53 и стадией заболевания [47, 125, 132].

В последние годы показано, что нарушение работы р53 происходит при его взаимодействии с другими белками-регуляторами митотического цикла — р21, Мdm2, bax.

Rb-ген локализуется в сайте 13q14, который подвергается делеции в 80% МРЛ (так же часто, как и при ретинобластоме) [18, 97]. Кодирует ядерный фосфопротеин массой 110 кДа и контролирует выход клетки из G1-фазы. Гипофосфорилирование Rb приводит к блокаде клетки на стадии G1 и к апоптозу. Инактивация Rb в опухолях достигается потерей одного из аллелей и мутацией второго аллеля гена. Экспрессия Rb отсутствует в 90% МРЛ и имеет плохое прогностическое значение. В НМРЛ экспрессия отсутствует в 30% случаев и не имеет прогностического значения.

Таким образом, инактивация р53- и Rb-генов- супрессоров имеет значительно большее значение для развития и прогрессии МРЛ, чем НМРЛ, что подтверждает разные пути онкогенеза этих опухолей.

Факторы роста, рецепторы к факторам роста

исвязывающие протеины при раке легкого

Впрогрессии РЛ факторы роста играют важную роль, обеспечивая с помощью аутокринной и паракринной стимуляции рост опухоли.

EGFR-мутации обнаруживаются в 10–40% НМРЛ [97, 149] и наиболее часто выявляются в аденокарциномах у некурящих пациентов. Наиболее хорошо описаны 2 члена семейства EGFR. Нормальная форма EGFBB1, ген EGFR, подвергается гиперэкспрессии в 80% случаев плоскоклеточного РЛ, более чем в 50% глиобластом

ив 80–100% случаев опухолей головы и шеи.

Второй член семейства EGFBB2 (называемый также HER2/NEU) амплифицируется в 25% карцином молочной железы и аденокарцином яичника, легкого, желудка и слюнных желез [65, 113]. На основании того, что в раковых клетках обнаруживатся характерная гиперэкспрессия EGFBB2, разработан новый метод таргетной терапии с помощью антител к EGFBB2, успешно применяемый в клинической практике и являющийся еще одним примером таргетной терапии опухолей [65, 113].

Экспрессиия EGFR обнаруживается в плоскоклеточном раке легкого и реже в других гистологических типах опухоли [18]. Онкоген Her2neu является независимым фактором прогноза, и его экспрессия свидетельствует о высокой степени злокачественности НМРЛ.

Интересные данные были получены по экспрессии инсулиноподобного фактора роста-2