3 курс / Патологическая физиология / АКТИН_МИОЗИНОВОЕ_ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ_В_МИОКАРДЕ_В_НОРМЕ_И_ПРИ_ХРОНИЧЕСКОЙ
.pdf
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ И ФИЗИОЛОГИИ» УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
Герцен Оксана Павловна
АКТИН-МИОЗИНОВОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В МИОКАРДЕ
В НОРМЕ И ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ КРЫС
СОЛЯМИ СВИНЦА И КАДМИЯ
03.03.01 «Физиология»
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
Доктор биологических наук Никитина Лариса Валерьевна
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, профессор, ЗДНРФ Кацнельсон Борис Александрович
Казань – 2021
1
ОГЛАВЛЕНИЕ |
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................. |
5 |
ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................... |
6 |
1 Литературный обзор........................................................................................ |
12 |
1.1 Миозин и его роль в мышечном сокращении.......................................... |
12 |
1.1.1 История открытия миозина ................................................................ |
12 |
1.1.2. Строение мышечного миозина млекопитающих ............................. |
12 |
1.1.3 Изоформы сердечного миозина и их свойства .................................. |
14 |
1.1.4 Фосфорилирование регуляторной легкой цепи миозина ................. |
18 |
1.1.5 Структура тонкого филамента сердечной и скелетной мышцы ...... |
22 |
1.1.6 Мышечное сокращение на молекулярном уровне ............................ |
23 |
1.1.7 Кальциевая регуляция мышечного сокращения ............................... |
25 |
1.1.8 Механизмы кооперативности сокращения в миокарде .................... |
26 |
1.1.9 Зависимость «pCa-скорость» и «рCa-сила» ...................................... |
28 |
1.2 Региональные особенности миокарда...................................................... |
30 |
1.2.1 Желудочки сердца и их особенности ................................................ |
30 |
1.2.2 Особенности предсердий ................................................................... |
34 |
1.3 Характеристика свинца и кадмия и их влияние на миокард .................. |
36 |
1.3.1 Характеристика и распространенность свинца ................................. |
36 |
1.3.2 Механизм действия свинца на организм ........................................... |
39 |
1.3.3 Характеристика и распространенность кадмия ................................ |
41 |
1.3.4 Механизм действия кадмия на организм........................................... |
43 |
1.3.5 Влияние свинца и кадмия на сердечно-сосудистую систему........... |
45 |
1.3.6 Возможные пути коррекции токсического воздействия свинца и |
|
кадмия .......................................................................................................... |
50 |
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................................... |
54 |
2.1 Объект исследования ................................................................................ |
54 |
2.2 Модель интоксикации............................................................................... |
54 |
2.2 Экстракция белков .................................................................................... |
58 |
2.2.1 Получение миозина ............................................................................ |
58 |
2
2.2.1 Получение актина ............................................................................... |
59 |
2.2.3 Получение тропонина......................................................................... |
61 |
2.2.4 Получение сердечного тропомиозина ............................................... |
62 |
2.2.5 Реконструкция регулируемого тонкого филамента .......................... |
63 |
2.2.6 Получение нативного тонкого филамента ........................................ |
64 |
2.2.7 Определение концентрации белков ................................................... |
65 |
2.3 Электрофоретическое разделение белков ............................................... |
65 |
2.3.1 Проверка состава тяжелых цепей миозина ....................................... |
65 |
2.3.2 Оценка чистоты актина, тропонина и тропомиозина ....................... |
67 |
2.3.2 Определение уровня фосфорилирования белков .............................. |
67 |
2.4 Метод in vitro Motility Assay .................................................................... |
69 |
2.4.1 Краткое описание метода in vitro Motility Assay............................... |
69 |
2.4.2 Структура проточной камеры ............................................................ |
70 |
2.4.3 Экспериментальная установка ........................................................... |
70 |
2.4.4 Ход эксперимента в in vitro Motility Assay........................................ |
71 |
2.4.5 Эксперимент в регулируемым тонким филаментом......................... |
72 |
2.4.6 Определение скорости скольжения филаментов .............................. |
73 |
2.4.7 Определение соотношения «рСа-скорость» и «pCa-фракция» ........ |
73 |
2.5 Статистическая обработка результатов ................................................... |
75 |
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................... |
76 |
3.1 Актин-миозиновое взаимодействие в разных отделах сердца ............... |
76 |
3.1.1Взаимодействие миозина с реконструированным тонким
филаментом.................................................................................................. |
76 |
3.1.2 Взаимодействие миозина с нативным тонким филаментом ............ |
80 |
3.2. Воздействие хронической интоксикации солями свинца на актин- |
|
миозиновое взаимодействие в разных отделах сердца ................................. |
84 |
3.3. Воздействие хронической интоксикации солями кадмия на актин- |
|
миозиновое взаимодействие в разных отделах сердца ................................. |
96 |
3
3.4. Воздействие комбинированной хронической интоксикации солями |
|
свинца и кадмия на актин-миозиновое взаимодействие и пути коррекции |
|
........................................................................................................................ |
102 |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ .......................................................................... |
110 |
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................................... |
113 |
4
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
A – предсердия (atria)
APS – персульфат аммония
cMLCK – сердечная киназа легкой цепи миозина cRLC – сердечная регуляторная легкая цепь миозина
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
ELC – существенная легкая цепь миозина
F–актин – филаментарный актин
h – коэффициент кооперативности Хилл
LV – левый желудочек (left ventricle) pCa50 – кальциевая чувствительность
PKC – протеинкиназа С
RLC – регуляторная легкая цепь миозина
RV – правый желудочек (right ventricle)
SDS – додецилсульфат натрия
TEMED – тетраметилэтилендиамин
TnC – тропонин C
TnI – тропонин I
TnT – тропонин T
Tm - тропомиозин
v/v – объем в объеме (при растворении)
V – скорость
Vmax – максимальная скорость
w/v – вес в объеме (при растворении)
АТФ – аденозинтрифосфорная кислота ДТТ – дитиотреитол ТЦМ – тяжелые цепи миозина
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Сердечно-сосудистые заболевания – основная причина смертности в мире [1], поэтому изучение структуры и функции сердца в норме и при патологии в настоящее время актуально. Все камеры сердца – и желудочки, и предсердия – имеют отличия в структуре и функции,
в том числе на уровне сократительных белков [2,3], поэтому каждый отдел должен изучаться наравне с остальными для понимания полной картины функционирования сердца. В настоящее время существует множество работ,
посвящённых различным отделам сердца на уровне органа [4,5]. На молекулярном уровне исследований значительно меньше, в частности,
известны исследования левого желудочка [6–8], реже встречаются работы,
посвященные правому желудочку [9] и немногочисленные исследования,
касающиеся различий между желудочками сердца [10,11] или связанные с предсердиями [12,13]. Актин-миозиновое взаимодействие в нормальном миокарде несмотря на существующие исследования [33–36] остается недостаточно изученным, а работ, посвященным особенностям актин-
миозинового взаимодействия разных отделов сердца в норме мало. При этом точное понимание структуры сердца является обязательным условием для понимания его функции не только в норме, но и при различных патологиях
[14].
На структуру и функцию сердца могут влиять различные факторы.
Воздействие токсичных веществ, в том числе тяжелых металлов, способствует возникновению и обострению существующих патологий сердечно-сосудистой системы [15]. Воздействию тяжёлых металлов, загрязняющих воздух производственных помещений и окружающую атмосферу, подвергаются значительные человеческие субпопуляции – работники промышленных предприятий и люди, проживающие в зоне их техногенного влияния [15,16].
Такие тяжелые цветные металлы, как свинец и кадмий, являются наиболее распространенными ксенобиотиками в среде обитания человека. Эти металлы присутствуют в воздухе, домашней пыли, почве, воде, продуктах питания и
6
других потребительских продуктах, а их накопление в среде характеризуются стойкостью и создаёт условия для хронического токсического воздействия на население через много лет после прекращения промышленной эмиссии
[15,17–21]. Показательным примером может служить Среднеуральский медеплавильный завод, сокративший выбросы в 50 раз за 25 лет, что привело к снижению концентрации свинца в корме и организме животных, обитающих в 20 км зоне, только в 2 раза, а концентрация кадмия при этом не изменилась
[20]. Свинец и кадмий накапливаются в организме человека и животных, в
особенности, в костях, из которых период их полувыведения составляет десятилетия. Было показано, что нет безопасного уровня содержания свинца в крови, и токсическое действие присутствует на уровнях, намного меньших,
чем предполагалось ранее [15,17].
В литературе имеются данные о токсическом влиянии свинца и кадмия на все системы организма, включая сердечно-сосудистую [18,22–30]. При этом известные опубликованные данные о воздействии свинца и кадмия на механическую активность миокарда малочисленны, не охватывают все её аспекты и отчасти противоречивы. Существенным недостатком этих работ является и то, что проявления системной свинцовой и кадмиевой интоксикации, на фоне которой развились те или иные нарушения сократительной функции миокарда, охарактеризованы и измерены, как правило, недостаточно. Между тем, именно такое сопоставление нарушений функции миокарда с выраженностью интоксикации на системно-
организменном уровне представляется необходимым, если мы хотим подтвердить наличие интоксикации и оценить реальное значение кардиотоксичности металлов.
Исследования кардиотоксического действия свинца и кадмия на уровне изолированных белков не проводились несмотря на то, что есть предположения о влиянии тяжелых металлов непосредственно на белки,
принимающие участие в сократительном акте [31,32].
7
С учетом вышеизложенного материала целью данной диссертационной работы стало исследование характеристик актин-миозинового взаимодействия в нормальном сердце и при воздействии изолированной и комбинированной хронической интоксикации крыс солями свинца и кадмия.
Всоответствии с данной целью были сформулированы следующие задачи:
1.Исследовать актин-миозиновое взаимодействие и его кальциевую регуляцию в норме в различных отделах сердца – правом желудочке, левом желудочке и предсердиях.
2.Изучить влияние хронической свинцовой интоксикации на функциональные характеристики миозина и экспрессию его изоформ в разных отделах сердца.
3.Изучить влияние хронической кадмиевой интоксикации на функциональные характеристики миозина и экспрессию его изоформ в разных отделах сердца.
4.Исследовать влияние комбинированной хронической интоксикации солями свинца и кадмия на функциональные характеристики миозина и экспрессию его изоформ в разных отделах сердца.
5.Исследовать влияние комбинированной интоксикации солями свинца и кадмия на функциональные характеристики миозина и экспрессию его изоформ в разных отделах сердца на фоне воздействия биопротекторного комплекса.
Научная новизна. В данном исследовании впервые экспериментально показано, что нативный тонкий филамент предсердий имеет более низкую скорость, чем тонкий филамент желудочков. Впервые было изучено проявление влияния хронической интоксикации солями свинца и кадмия на сердечную мышцу на уровне сократительных белков, а также проведено сравнение изолированных и комбинированных эффектов свинца и кадмия на актин-миозиновое взаимодействие и его регуляцию в миокарде. Данное исследование проведено вместе с оценкой системной токсичности этих металлов. Впервые проведено сравнение кардиотоксического влияния свинца
8
и кадмия (как изолированного, так и комбинированного) на характеристики актин-миозинового взаимодействия и его регуляцию в различных отделах сердца крыс, подвергшихся хронической интоксикации. Впервые проведена оценка изменения экспрессии изоформ тяжелых цепей миозина в разных отделах сердца в ответ на интоксикацию солями свинца и кадмия. Впервые исследовано проявление токсического влияния этих металлов на сердечную мышцу на уровне сократительных белков на фоне воздействия на крыс биопротекторного комплекса.
Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные в работе данные расширяют представления об особенностях актин-миозинового взаимодействия и его кальциевой регуляции в разных отделах сердца и о механизмах влияния тяжелых металлов на функциональные характеристики и изоформный состав миозина. Помимо выявления новых фактов и знаний о механизмах токсичности свинца и кадмия, наше исследование может служить фундаментом для дальнейших практических исследований, связанных с мониторингом, диагностикой и профилактикой токсичности свинца и кадмия.
Методы исследования. Белые аутбредным крысам-самцам вводились внутрибрюшинные инъекции для моделирования комбинированной и изолированной хронической интоксикации солями свинца и кадмия. Для исследования эффективности биопротекторного комплекса его давали крысам с кормом и питьем. Экстрагирование сократительных и регуляторных белков для исследования происходило согласно стандартным методикам. Кроме того,
использовались такие современные биофизические методы исследования как искусственная подвижная система (in vitro motility assay) для изучения характеристик взаимодействия сократительных и регуляторных белков на уровне ансамбля молекул, электрофоретическое разделение белков для определения изоформного состава тяжелых цепей миозина и Pro-Q Diamond
Phosphoprotein Blot Stain Kit для определения наличия фосфатных групп в легких цепях миозина. Исследования проводились на базе Института иммунологии и физиологии УрО РАН и Екатеринбургского медицинского-
9
научного центра профилактики и охраны здоровья рабочих промышленных предприятий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Статистическая обработка данных производилась как с помощью специализированных программ (GMimPro,
ImageLab), так и общепринятого программного обеспечения (OriginPro, Microsoft Excel, STATISTICA).
Основные положения, выносимые на защиту:
1.Характеристики актин-миозинового взаимодействия в норме отличаются в зависимости от отдела сердца и зависят как от изоформного состава миозина, так и от особенностей тонкого филамента этих отделов.
2.Изолированные интоксикации солями свинца и кадмия влияют на актин-миозиновое взаимодействие во всех отделах сердца. Их комбинация оказывает влияние на актин-миозиновое взаимодействие, но не является суммой двух изолированных интоксикаций.
3.Влияние хронической комбинированной свинцово-кадмиевой интоксикации на сократительную функцию сердечной мышцы и ее регуляцию нивелируется в различных отделах сердца с разной степенью при поступлении
ворганизм биопротекторного комплекса
Степень достоверности полученных результатов. Достоверность представленных данных и выводов, приведенных в диссертационной работе,
определяется использованием значительного количества экспериментальных данных, современных методов исследования белков и статистической обработки данных.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на нижеследующих научных конгрессах и конференциях: VI и VII
Международной молодежной научной конференции «Физика. Технологии.
Инновации» (Екатеринбург, 2019 и 2020), 55-м конгрессе Европейского общества токсикологии (Хельсинки, 2019), III молодежной школе-
конференции «Молекулярные механизмы регуляции физиологических функций» (Москва, 2019), Российском национальном конгрессе кардиологов
10