3 курс / Патологическая физиология / АКТИН_МИОЗИНОВОЕ_ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ_В_МИОКАРДЕ_В_НОРМЕ_И_ПРИ_ХРОНИЧЕСКОЙ

улучшают функцию сердца снижая количество свинца в миокарде [119].

Кальций-содержащая добавка может служить кардиопротектором, а так снижать системное проявление токсичности свинца [136,163].

Цинк является мощным индуктором металлотионеинов, которые играют важную роль в защите от токсичности тяжелых металлов, включая кадмий.

Цинк обладает способностью снижать поглощение кадмия, в том числе,

независимо от металлотионеинов, и таким образом снижать интоксикацию

[167].

Селен и цинк могут оказывать совместное действие при защите от структурного повреждения, вызванного кадмием, в печени, но не в почках

[168]. Цинк и медь способны ингибировать поглощение кадмия кардиомиоцитами, при чем наибольший эффект достигается при одновременном воздействии меди и цинка. При самой высокой концентрации

– 30 мМ для каждого металла – цинк и медь вызывали ингибирование поглощения кадмия на 79 %. Однако, ни цинк, ни медь не оказали какого-либо значительного влияния на выход кадмия из кардиомиоцитов [152].

Возможно участие кальциевых каналов в транспорте кадмия. Четыре антагониста кальциевых каналов могут ингибировать поглощение кадмия в разной степени. Верапамил был наиболее эффективным антагонистом Ca2+-

канала, ингибируя 76 % накопления кадмия при концентрации 200 мМ, затем следовали нитрендипин – 52 %, дилтиазем – 50 % и нифедипин – 29 % [133].

Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA-Na2),

синтетический хелатообразующий агент, впервые синтезированный в Германии в 1930-х годах, имеет до 6 сайтов связывания, с помощью которых можно удерживать ионы металлов. EDTA-Na2 эффективна при лечении отравления у работников военно-морской верфи после использования краски на основе свинца [27]. Экспозиция соединениями свинца и кадмия связана с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, в то же время хелатирующая терапия EDTA-Na2 – около 40 инфузий в течение 1 года – снижала риск сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с перенесенным

51

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

инфарктом миокарда. Исследователи полагают, что инфузии EDTA-Na2 могут снизить общую нагрузку свинца на организм, однако снижения содержания кадмия в организме при этом не значительно [169].

Современные исследования показывают, что лечение куркумином ослабляет нарушения нервной системы, вызванные токсичностью свинца, что может быть связано с антиоксидантными и хелатирующими свойствами куркумина [148,170], а использование экстракта виноградных косточек оказывает лечебное воздействие при гипертонии, вызванной свинцом [171].

Эффективным средством снижения токсичности свинца может служить экстракт листьев моринги масличной [172]. Эти данные свидетельствуют о новом подходе к стратегиям лечения токсичности тяжелых металлов с помощью добавок микроэлементов.

Результаты экспериментальных исследований на животных

(моделирование субхронической интоксикации свинцом, кадмием,

мышьяком, хромом, фтором, марганцем, ванадием, фенолом, нафталином,

формальдегидом, бенз(а)пиреном в различных комбинациях) говорят о положительном влиянии на организм комплекса биопротекторов – пектина,

глутамата натрия, добавок, содержащих кальций, йод, железо, витамины и некоторые аминокислоты [137,173,174]. Комплекс биопротекторов более эффективен по сравнению с однофакторным биопротектором [173].

В заключение можно отметить, что в настоящее время установлено влияние свинца и кадмия на различные органы и системы: печень, почки,

нервную систему. Известны многочисленные эпидемиологические работы,

касающиеся сердечно-сосудистой системы, однако экспериментальных исследований очень мало, и механизм влияния на структуру и функцию сократительных белков, а также их кальциевую регуляцию ранее не изучался.

Особенно важным представляется изучение функции миозина – сократительного белка миокарда – в разных отделах сердца. Предсердия и желудочки имеют свои особенности в структуре и функции, следовательно,

52

можно ожидать, что характеристики актин-миозинового взаимодействия могут отличаться в зависимости от отдела сердца, как в норме, так и при адаптации к различным патологическим состояниям, включая воздействие тяжелых металлов.

Как известно свинец и кадмий стойко накапливаются как во внешней среде, так и внутри организма, следовательно, оценка способов защиты от негативного воздействия этих тяжелых металлов является актуальной задачей.

53

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1Объект исследования

Вэкспериментальной работе на всех этапах белые аутбредные крысы-

самцы, выращенные в племенной колонии ФБУН «Екатеринбургский медицинский-научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промышленных предприятий» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Все крысы содержались в стандартных условиях, дышали нефильтрованным воздухом и были обеспечены стандартной сбалансированной пищей [136,164,175].

Эксперименты планировались и проводились в соответствии с

«Международными руководящими принципами биомедицинских исследований на животных», разработанными Советом международных организаций медицинских наук (1985), и были одобрены Комитетом по этике Екатеринбургского медицинского научно-исследовательского центра профилактики и охраны здоровья работников промышленных предприятий

(ЕМНЦ) и Этическим комитетом Института иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук.

2.2 Модель интоксикации

Экспериментальная работа проводилась в два этапа, на каждом из которых нашими коллегами из ЕМНЦ осуществлялась проверка наличия хронической интоксикации в соответствующих экспериментальных группах.

На первом этапе использовались крысы с начальной массой тела около

300 грамм и возрастом 4 месяца на начало эксперимента. Для экспериментального моделирования хронической интоксикации свинцом крысам (n=10) вводили раствор ацетата свинца внутрибрюшинными инъекциями три раза в неделю (до 15 инъекций) в однократной дозе 12,5 мг Pb

на 1 кг массы тела. Доза была подобрана в ходе предыдущих экспериментальных испытаний как вызывающая неблагоприятные сдвиги по функциональным и биохимическим показателям состояния организма, но не

54

приводящая к летальному исходу. Контрольные животные (n=10) получали тот же объем дистиллированной воды аналогичным способом.

Модель интоксикации, создаваемая путём внутрибрюшинных инъекций, как и любая модель (необходимое упрощение сложной системы),

имеет свои недостатки и достоинства. Одним из последних является тот факт,

что дозирование инъекцией является наиболее точным, надежным и воспроизводимым по сравнению с такими экспериментальными методами, как вдыхание или поглощение с пищей. Моделирование хронических интоксикаций с помощью внутрибрюшинных инъекций хорошо известно в экспериментальной токсикологии, и широко используется различными исследователями в экспериментальных токсикологических исследованиях

[176].

За 15 минут перед эвтаназией путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом крысам вводили гепарин (1000 ME – 0.25 мл). Немедленно после эвтаназии извлекали сердце, которое на 15 минут помещали в физиологический раствор. Далее сердце разрезали на отделы, замораживали в жидком оксиде азота и перемещали на хранение в холодильную камеру с поддержанием температуры -86 ºC.

На втором этапе в исследовании использовались крысы возрастом 3,5

месяца с массой тела 220-225 г на начало эксперимента. Всего в экспериментальной серии использовалось 5 групп крыс: контрольная группа

(n=10), группа Pb (n=10), группа Cd (n=10), группа Pb+Cd (n=10) и группа

Pb+Cd+биопротекторный комплекс (n=10).

Для развития хронической интоксикации крысам вводили растворы ацетата свинца и / или хлорида кадмия путем повторных внутрибрюшинных инъекций три раза в неделю в течение 6 недель (до 18 инъекций) в

однократных дозах 6,01 мг Pb и 0,377 мг Cd на кг массы тела. Данные дозы были выбраны в ходе предшествующих экспериментальных испытаний как вызывающие неблагоприятные сдвиги по определенным функциональным и

55

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

биохимическим показателям состояния организма, но не вызывающие слишком тяжелой интоксикации с летальным исходом.

Случайно отобранной половине крыс, подвергшихся воздействию комбинации Pb+Cd, в течение периода воздействия вводили биопротекторный комплекс – комплекс биологически активных препаратов, включающий глютамат натрия («Neimenggu Fufeng Biotechnologies Co., Ltd», Хух-Хото,

Китай), цистеин в метаболически активной форме N-ацетилцистеина и яблочный пектин (ООО «Промавтоматика»: Белгород, Россия), кверцетин в виде рутина (Аскорутин, ООО «Марбиофарм»:, Йошкар-Ола, Россия),

препарат рыбьего жира, богатый полиненасыщенными жирными кислотами класса омега-3, витамины А, С, Е и D3 (Ecco-Plus Ltd .: Жуковский, Россия),

селен, йод, кальций, железо, магний, витамины группы В1, В2 и В6 («Multi-

Tabs Classic», «Ferrosan A / C», Дания; Complivit Calcium D3, ООО

«Фармстандарт-УфаВИТА», Уфа, Россия). Таблетки были измельчены и добавлены к порции корма в количествах, соответствующих рекомендуемой суточной дозе этих микроэлементов для крыс. В случае, если рекомендации были известны только для людей, пересчет потребностей в питании крысы был сделан на основании обмена веществ крыс. Дозы и способы введения веществ биопротекторного комплекса представлены в таблице 1 [137].

Учитывая, что стандартный сбалансированный корм удовлетворяет обычным потребностям крысы, есть предположение, что дополнительное потребление перечисленных выше биологически активных веществ будет отвечать возросшим потребностям, связанным с адаптацией к интоксикации.

Биопротекторный комплекс был проверен нашими коллегами в эксперименте на группе крыс, не подвергавшихся воздействию какого-либо токсиканта

[137,164].

Данный биопротекторный комплекс включал в состав вышеназванные вещества по следующим соображениям:

1. Глутамат является эффективным стабилизатором клеточной мембраны, который действует за счет увеличения синтеза АТФ под

56

воздействием повреждающего действия различных токсических веществ

[177–180] и в то же время, как один из предшественников глутатиона, который является мощным защитником клеток от окислительного стресса.

2.Цистеин – предшественник глутатиона в высокоактивной и доступной форме N-ацетилцистеина [137].

3.Компоненты антиоксидантной системы организма (витамины А, Е

иС, селен) и рутин (антиоксидант флавоноид) – являются биопротекторами против многих неблагоприятных воздействий токсинов [137].

4.Витамины группы В – гематопоэтические факторы, способные предотвратить «свинцовую» анемию [137].

5.ω-3 полиненасыщенные жирные кислоты играют важную роль в защите организма от неблагоприятных воздействий, так как их внутриклеточные производные являются эйкозаноидами, которые активируют репликацию ДНК и, таким образом, играют важную роль в ее восстановлении

[179–181].

6.Йодная добавка может служить эффективным протектором от сложных нарушений функции щитовидной железы, вызванные свинцом и некоторыми другими интоксикациями [182].

7.Железо – необходимо для противодействия хорошо известному ингибирующему действию свинца на феррохелатазу, которая катализирует включение Fe2+ в протопорфирин IX на последней стадии синтеза гема [183].

8.Кальций – может служить как эффективный протектор, поскольку кальций активно участвует в токсикокинетике и токсикодинамике свинца и является его антагонистом [137].

9.Магний – играет важную роль в функционировании миокарда

[184,185].

10. Пектиновый энтеросорбент – является агентом, который предотвращает повторное поглощение токсичных металлов, выделяемых с желчью в кишечник [137].

57

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Таблица 1. Состав дозы и пути введения биопротекторного комплекса [137]

За несколько минут до умерщвления (цервикальная дислокация под эфирным наркозом) крысам вводили внутривенно гепарин (0,2 мл, 5000

единиц) и миорелаксант ксилазина (0,3 мл). Сразу после этого вскрывалась грудная клетка, спонтанно сокращающееся сердце удаляли и помещали на 15

минут в чашку Петри с модифицированным раствором Кребса-Хенселейта.

Затем сердце разрезали на отделы, полученную сердечную ткань замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -86 ºС.

2.2 Экстракция белков

2.2.1 Получение миозина

Растворы и буферы для получения миозина

Состав раствора №1: 2 % тритона Х-100, 0,5 мМ фенилметилсульфонил флуорида, 5 мМ ДТТ, 4 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA и 20 мМ фосфатного буфера

(рН 6,5).

58

Состав буфера №2: 1 мМ АТФ, 4 мМ MgCl2, 1 М KCl, 40 мМ фосфатного буфера (рН 6,5).

Состав высокоионного буфера №3: 40 мМ фосфатного буфера,1 М KCl,

4 мМ MgCl2 (рН 6.5).

Методика получения миозина

Миозин экстрагировался из сердечной ткани разных отделов сердца (предсердия, правый и левый желудочек) крыс всех групп. Сердечную ткань каждого отдела в течение 10 минут измельчали в специальном растворе №1 в соотношении 1:10 (w/v) и выдерживали в холодильнике при температуре 4 С

в течение 10-15 минут. Данную смесь центрифугировали при 14500 g в течение 15 минут, и полученный осадок в течение 30 минут экстрагировали в буфере №2 в соотношении 1:3 (w/v). Затем смесь с данным буфером центрифугировали в течение 15 мин при 14500 g, а полученный после центрифуги супернатант смешивали с деионизированной водой в соотношении 1:10 (w/v). Этот раствор выдерживали при температуре 4 С в течение 20 минут. После чего центрифугировали в течение 15 минут при 14500 g, и полученный осадок миозина растворяли в высокоионном буфере №3 в соотношении 1:2 (w/v). Миозин хранился не более суток до начала эксперимента. Все операции по выделению миозина и его хранение проводились при температуре 4 С.

2.2.1 Получение актина

Растворы и буферы для получения актина

Состав раствора Губа-Штрауба: 0,3 М KСl, 0,1 M KH2PO4, 0,05 М K2HPO4, 0,1 М EGTA, 1 мM ДTT (pH 6,5).

Состав буфера №1: 2 мМ Tris-HCl, 0,2 мМ Na2АТФ, 0,2 мМ CaCl2, 0,005 % NaN3, 0,5 мМ ДТТ (рН 8,0).

Методика получения актина

Для исследований функциональных характеристик миозина мы использовали реконструированный тонкий филамент, который включал актин скелетных мышц кролика. Это широко используемая практика, так как актин

59

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

является высококонсервативным белком среди разных видов животных.

Актин выделяли по методу Pardee с незначительными модификациями [186]

из ацетонового порошка, полученного из белых ножных мышц и продольных мышц спины и кролика.

Мышцы спины и белые мышцы ноги кролика помещали на лед в течение

30 минут. С помощью мясорубки очищенные от кровеносных сосудов, жировой и соединительной ткани мышцы кролика перемалывали в фарш, и в течение 15 минут экстрагировали в растворе Губа–Штрауба в соотношении

300 мл раствора к 100 г фарша. Данную смесь центрифугировали в течение 20

минут при 5000 g, затем полученный садок перемешивали в течение 10 минут с 1 л раствора 0,05 М NaHCO3, после чего жидкость удаляли путем центрифугирования и повторяли эту процедуру с раствором 1 л 1 мМ EDTA (рН 7,0). Осадок промывали деионизированной водой два раза по 5 минут.

После центрифугирования осадок промывали 500 мл ацетона 4 раза по 10

минут. Все используемые растворы были охлаждены до 4 °С. Полученный ацетоновый порошок высушивали при комнатной температуре в вытяжном шкафу в течение ночи, и для дальнейшего использования хранили в морозильной камере при температуре -20 °С.

Экстракция актина из ацетонового порошка происходила при постоянном перемешивании в течение 30 мин в буфере №1 в соотношении 20 мл буфера на 1 г ацетонового порошка. Полученный экстракт центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут, а затем центрифугировали при 80000 g в течение 60 минут. Супернатант фильтровали через фильтр

Whatman®54 22 мкм. Для полимеризации актина концентрацию КСl в

супернатанте увеличивали до 50 мМ, МgCl2 – до 2 мМ, АТФ – до 1 мМ. Время полимеризации – около 2 часов.

Для осаждения присутствующего тропомиозина в раствор полимеризованного актина медленно в течение 30 минут добавляли перемешивая твердую соль КСl до конечной концентрации 0,8 М (рH 8,3-8,5).

Полимеризованный актин центрифугировали в течение 1 часа при 300 000 g

60