3 курс / Патологическая физиология / АКТИН_МИОЗИНОВОЕ_ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ_В_МИОКАРДЕ_В_НОРМЕ_И_ПРИ_ХРОНИЧЕСКОЙ

ремоделирование сердца, проявляющееся в развитии гипертрофии и снижении сократимости [52].

Фосфорилирование RLC миокарда правого желудочка крысы увеличивает активную силу и чувствительность к кальцию и изменяет структуру толстой нити – головки миозина становятся более перпендикулярными к оси филамента. На нефосфорилированных головках миозина происходят сходные структурные изменения в случае фосфорилирования RLC соседних головок, что демонстрирует передачу сигналов между головками миозина. Это означает, что скоординированные и совместные структурные изменения в толстых и тонких филаментах являются основополагающими для физиологической регуляции сократимости миокарда

[75].

Кроме того, фосфорилирование RLC миокарда связано с изменением механических характеристик миозина, способствующих регуляции сокращения и ответной реакции мышцы на патологию. В частности,

фосфорилирование RLC левого желудочка свиней на Ser15 приводит к доминированию шага длиной 8 нм по сравнению с шагами 3-5 нм для β-

тяжёлой цепи миозина в отсутствие фосфорилирования. Увеличение среднего размера шага миозина увеличивает объем работы, произведенной за один цикл АТФазы [53].

Уровень фосфорилирования RLC миозина может зависеть от многих факторов – вида животного, гормонального фона, состояния здоровья,

изменений в сократительной активности сердца. При этом не найдено связи между уровнем фосфорилирования миозина и возрастными изменениями человека [76]. Отмечено увеличение уровня фосфорилирования RLC миозина папиллярной мышцы при стимуляции норэпинефрином [77]. В свою очередь,

фосфорилирование RLC миозина модулирует клеточные функции, такие как сокращение мышц, митоз и цитокинез [50].

Различные поражения миокарда могут приводить к таким изменениям,

как изменения в экспрессии многочисленных белков и модуляцию экспрессии

21

генов, а также посттрансляционные модификации существующих белков [78].

Снижение фосфорилирования RLC является ключевым фактором нарушения сократительной функции в пораженном миокарде [79]. Поскольку фосфорилирование RLC миозина модулирует поведение мышечных клеток,

нарушение её фосфорилирования приводит к дисфункции и заболеванию.

Мутации в RLC связаны с миопатиями в сердце человека. В то же время не только нарушение процесса фосфорилирования вовлечено в ряд заболеваний,

но и в свою очередь изменение фосфорилирования RLC является компенсаторным механизмом при заболеваниях сердца [16]. Например,

фосфорилирование RLC миозина у крыс и людей снижается при наследственной сердечной кардиомиопатии и после инфаркта, но повышается при сердечной недостаточности, а также при усугублении патологии сердца

[16,68,79,80]. Некоторые патологии сердца могут приводить к временному снижению уровня фосфорилирования RLC миозина, как начальному компенсаторному гипердинамическому ответу, и, вследствие, постепенному возвращению к норме или повышению уровня фосфорилирования [16,78].

Существуют данные о снижении уровня фосфорилирования RLC

сердечного миозина крыс в ответ на отрицательные инотропные факторы,

такие как соединения свинца и кадмия [23]. Средний инотропный ответ сердец у животных, получающих кадмий, эквивалентен идентично обработанным сердцам из группы, получающей свинец и кадмий, несмотря на более высокий уровень фосфорилирования RLC (на 21%). Однако эти различия в фосфорилировании могут отражать изменения в обороте фосфата RLC, на который влияют различные агенты, посредством прямого или косвенного контроля ферментов, участвующих в фосфорилировании-

дефосфорилировании регуляторной легкой цепи [23].

1.1.5 Структура тонкого филамента сердечной и скелетной мышцы

Согласно гипотезе скользящих нитей сокращение поперечнополосатых мышц на молекулярном уровне происходит в результате движения тонких филаментов вдоль толстых без изменения их длины [40].

22

Толстые филаменты состоят, в основном, из миозина, а тонкие филаменты главным образом образованы актином. Актин – это сократительный белок с молекулярной массой 42 кДа. Молекулы G-актина

(глобулярный мономер актина) могут полимеризоваться, образуя F-актин

(филаментарный актин) [39,81]. Спирально расположенные полимеры актина образуют основу тонкого филамента совместно с регуляторными белками – тропомиозином и тропонином – присоединенными к актину в соотношении

7:1:1 (A:Tpm:Tn) [35].

Тропомиозин (Tm) – регуляторный белок, состоящий из двух субъединиц массой около 33 кДа, представляет собой левозакрученную суперспираль. Соседние молекулы тропомиозина связаны между собой по принципу «хвост к голове» и образуют длинный тяж, который тянется вдоль всего актинового филамента. Одна молекула тропомиозина связывается с семью актиновыми мономерами и перекрывает смежные тропомиозины

[35,39,82].

Каждая молекула тропомиозина связана с одним тропониновым комплексом. Тропонин – глобулярный белок молекулярной массой около 80

кД, в состав которого входят три субъединицы: ТnI ( 24 кДа), ТnС ( 18 кДа),

ТnТ ( 38 кДа). ТnI способен соединяться с актином, фиксируя весь тропонин-

тропомиозиновый комплекс на его поверхности, и тем самым ингибируя связывание миозиновых головок с актином и, соответственно, их АТФазную активность, либо сам присоединяется к ТnС, ослабляя связь регуляторных белков с актином. ТnС обладает свойством связывать ионы кальция. ТnТ

обеспечивает связь TnI и TnC между собой и с тропомиозином [35,39,83,84].

1.1.6 Мышечное сокращение на молекулярном уровне

Каждая головка миозина может связывать с помощью ионов магния

(Mg2+) одну молекулу АТФ в нуклеотид-связывающем сайте. Комплекс миозин-АТФ расположен под углом 45 º к остальной части молекулы. В таком состоянии миозин имеет очень слабое сродство к актину, на поверхности которого имеются сайты для слабого (в основном электростатического) и

23

сильного связывания миозина. При физиологических концентрациях АТФ (3– 5 мМ), связывание АТФ с миозином происходит быстро и является необратимым. Последующее отделение актина от комплекса актин-миозин-

АТФ происходит также быстро. При активации актином миозиновой АТФазы,

происходит изгиб области шейки миозина, что сопровождается, в свою очередь, гидролитическим расщеплением АТФ до АДФ и неорганического фосфата. После чего в результате конформационных изменений головки миозина выпрямляются и их сродство к актину увеличивается на 4 порядка.

Неорганический фосфат отделяется от комплекса, что вызывает отклонение головки на 40 º. Это приводит к тому, что актиновые и миозиновые филаменты скользят друг относительно друга. После расщепления АТФ до АДФ и неорганического фосфата миозин вновь слабо связывается с актином, но без ионов Ca2+ тропомиозин стерически блокирует доступ миозиновых головок к сайтам сильного связывания на актине [35,85].

Сильное связывание миозина с актином связано с движением верхнего и нижнего 50-кДа субдоменов тяжёлой цепи миозина навстречу друг другу

(т.н. «закрытием челюстей»). Это движение сопровождается расширением области шейки миозина и открытием пути для высвобождения неорганического фосфата из АТФ-связывающего кармана в миозине.

Удлинение шейки миозина является силогенерирующим – при изометрическом сокращении происходит растяжение упругого элемента примерно на 10 нм и создается сила ~ 2 пН на 1 поперечный мостик. В

неизометрических условиях укорочение шейки заставляет толстые и тонкие филаменты скользить вдоль друг друга. Эта стадия ограничивает скорость в цикле поперечного мостика [35].

Известно, что в трабекулах правого желудочка крысы в каждой половине миозинового филамента имеется 294 головки, но только около 29 из них присоединены к актину в момент достижения максимальной силы. При этом сила составляет 4,4 пН на 1 поперечный мостик. В среднем на 294

головки миозина гидролизуется 400 молекул АТФ (1:1.3) [86]. Каждая

24

половина филамента содержит 49 слоев миозиновых моторов с осевым расстоянием около 14,5 нм, начиная примерно с 80 нм от середины филамента.

Слои с 7 по 31 находятся в районе миозин-связывающего C-белка (C-зона).

Пик силы сокращения в электрически стимулированной сердечной мышце достигается двигателями С-зоны миозиновой нити [86].

1.1.7 Кальциевая регуляция мышечного сокращения

предполагается, что существует три состояния тонкого филамента [87,88]:

1.Заблокированное состояние, когда в отсутствие Ca2+ тропомиозин

«блокирует» доступ к сайтам сильного связывания тонкого филамента [35,87].

2.Закрытое состояние, когда в присутствии кальция тонкий филамент частично активируется и головки миозина могут слабо связываться с актином [35,89].

3.Открытое состояние связано с полной активацией регуляторной единицы тонкого филамента, когда после связывания двух головок миозина с актином, около 11 других головок миозина могут сильно

связываться с актином и образовывать поперечные мостики [35,89].

В результате повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция

(Ca2+) происходит связывание Ca2+ с TnС, затем TnI отсоединяется от актина,

позволяя комплексу Tm/Tn двигаться по поверхности тонкого филамента и перемещаться в положение, которое способствует временному открытию сайтов для сильного связывания с комплементарными областями в 50 кДа-

домене миозина. Чем больше концентрация Ca2+, тем дольше комплекс Tm/Tn

обеспечивает доступ миозина к сайтам сильного связывания [35,62,84].

Регуляция мышечного сокращения с помощью Ca2+ приводит к изменениям в тонком филаменте, хотя модуляция может происходить также и через миозин

[35,62].

Как сказано выше, отсоединение TnI от актина, опосредованное ионами кальция, позволяет тропомиозину перемещаться по поверхности тонкого

25

филамента. Тропомиозин – гибкая молекула, и ее положение следует считать динамическим; тропомиозин не занимает единую фиксированную позицию в присутствии повышенной концентрации Ca2+, а движется назад и вперёд по поверхности актина, открывая места для связывания с головками миозина.

Тропомиозин может занимать три различных субпозиции вдоль спиральной бороздки актина и образует непрерывные связи «от головы к хвосту» вдоль актина. Данный структурный механизм необходим для кооперативного связывания миозина вдоль тонкого филамента. Этот сложный набор взаимодействий позволяет мышцам быстро переключаться между активным и неактивным состояниями в зависимости от концентрации кальция [89].

Когда головка миозина прочно связывается с актином, тропомиозин стабилизируется в положении, которое делает доступными сайты как для слабого, так и для сильного связывания миозина на соседних актиновых мономерах. Таким образом, активация тонкого филамента достигается движением тропомиозина по поверхности актина, которое контролируется как связыванием Ca2+ с тропонином C, так и начальным связыванием с актином,

что обеспечивает дополнительное образование поперечных мостиков. Это движение тропомиозина позволяет генерировать силу. Скорость образования поперечных мостиков (сильного связывания) зависит от концентрации ионов кальция и положения тропомиозина [35,62].

Таким образом, сокращение представляет собой активацию и деактивацию тонкого филамента, регулируемую изменением концентрации ионов кальция, с последующим взаимодействием головок миозина с актином.

1.1.8 Механизмы кооперативности сокращения в миокарде

Наиболее упрощенная модель цикла поперечного мостика показывает взаимодействие одной молекулы миозина с одной молекулой актина [64].

Однако связывание Ca2+ и последующее образование поперечных мостиков

(сильное связывание) пространственно расширяют активацию тонкого филамента до 12–14 актинов, то есть за пределы 7 актинов, охватываемых одним тропомиозином. Эта активация соседних регуляторных групп

26

(A7TmTn) кальцием и поперечными мостиками лежит в основе явления кооперативности [35].

При взаимодействии тонкого и толстого филаментов известно 4

возможных механизма, благодаря которым происходит кооперативное увеличение количества поперечных мостиков [88]:

1.Ca-TnC – один из возможных механизмов кооперативности в мышце, вклад которого в коэффициент кооперативности равен 1,2 в скелетной мышце, поскольку на скелетном TnC имеется два свободных сайта для связывания кальция. Однако в сердечной мышце TnC может связать только одну молекулу кальция, поэтому данный механизм кооперативности не проявляется в сердечной мышце [88]. Известно, что при замене сердечного на скелетный TnC коэффициент кооперативности Хилла кривой pCa-сила в трабекулах правого желудочка хомяка повышается на 58% [90].

2.СaTnC-CaTnC – механизм кооперативности, когда связывание

Ca2+ с одним сайтом тропонина C, увеличивает возможность связывания ионов

Ca2+ с соседними сайтами TnC вдоль одного тонкого филамента. Это возможно благодаря взаимодействию тропомиозина по принципу «голова к хвосту».

Этот механизм может играть ключевую роль в активации сокращения в миокарде [88].

3. Xb-СаTnC (мостик-тропониновая кооперативность) – механизм кооперативности, при котором связывание Ca2+ с одной субъединицей тропонина C повышает возможность сильного связывания поперечных мостиков в одном тонком филаменте, что, в свою очередь, увеличивает сродство Ca2+ к тропонину C близлежащих регуляторных групп A7TmT [88].

Имеются свидетельства о важной роли этого механизма кооперативности в сердце [88], однако есть данные, что активация кальцием сердечного тонкого филамента позволяет немедленно образовывать большое количество поперечных мостиков, и этот шаг подавляет второй миозин-зависимый шаг активации. Как связывание Ca2+ с TnC, так и образование поперечных мостиков обеспечивают ~70% от максимальной активации в сердечной

27

мышце, в то время как в скелетной мышце кальций обеспечивает 20% от максимальной активации, а ригор миозина – 30% [91]. Следовательно, вклад данного механизма в активацию сокращения в сердце может быть не столь значителен [92].

4. Xb-Xb – важный механизм кооперативности в миокарде, при котором прямая активация тонкого филамента сильно связанными поперечными мостиками не зависит от изменений в связывании ионов Ca2+.

Образование поперечных мостиков может усиливать связывание поперечных мостиков в этом же звене или в соседних. Этот механизм может облегчить дополнительное образование поперечных мостиков после связывания кальция с Tn и движения Tpm. Кроме того, сильно связанные нециклирующие поперечные мостики (в присутствии NEM-миозина) могут активировать АТФазную активность головки миозина и регулируемого тонкого элемента, а

также повышать кальциевую чувствительность. Повышение кооперативности и/или кальциевой чувствительности может происходить в результате увеличения длины саркомера, уменьшения расстояния между актином и головками миозина или движения головки миозина, в обратном направлении от тонкого филамента, что способствует фосфорилированию легких цепей миозина. Данный механизм не является наиболее влиятельным в сердечной мышце [88,93], по сравнению со скелетной, в которой при связывания двух головок миозина образуется активирующий участок (activation patch),

позволяющий связываться 11 миозинам [89].

Предполагается, что в основе кооперативности в сердечной мышцы лежат два основным механизма – СaTnC-CaTnC и Xb-СаTnC [88,94].

1.1.9 Зависимость «pCa-скорость» и «рCa-сила»

На скинированных кардиомиоцитах было показано, что скорость ненагруженного укорочения и изометрическая сила повышаются с увеличением концентрации кальция [95].

Диссоциация АДФ от актомиозина ограничивает зависимую от АТФ скорость диссоциации актомиозин-АДФ и ограничивает скорость

28

отсоединения поперечного моста в сокращающейся мышце, то есть ограничивает максимальную скорость укорочения этих мышц [96].

В in vitro Motility Assay скорость движения регулируемых тонких филаментов, состоящих из актина, тропонина и тропомиозина, в отличие от F-

актина возрастает с увеличением в растворе концентрации Ca2+. При значениях рСа ≤ 5,0 (отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция в микромолях) около 80-90 % регулируемых тонких филаментов двигаются с максимальной скоростью, в то время как при значениях рСа ≥ 8,0

тонкие филаменты, как правило, не двигаются [34,97]. Существуют данные,

что кривая зависимости «pCa-скорость» в in vitro Motility Assay лишена кооперативности, то есть коэффициент кооперативности Хилла равен 1 [97],

однако другие авторы показывают обратное. Тем не менее коэффициент кооперативности Хилла зависимости «pCa-скорость», как правило, не превышает 2,2, в то время как зависимость «pCa-скорость-фракция подвижных филаментов» обладает более высокими значениями коэффициента Хилла.

С помощью in vitro Motility Assay было найдено, что изометрическая сила (в данном случае – процентное соотношение α-актинина,

останавливающего движение в проточной камере, к общему количеству белка)

для изоформы V1 была в два раза ниже по сравнению с V3 при насыщающей концентрации кальция. На основании этих данных авторы сделали вывод, что при снижении концентрации миозина коэффициент кооперативности Хилла возрастает [36]. Известно, что изменение экспрессии α или β-тяжелых цепей сердечного миозина крыс также не оказывает значительного влияния на максимальную Ca2+-активированную силу при насыщающей концентрации кальция, таким образом, различные изоформы миозина не имеют различий в генерации силы [98].

Сравнение кривых «pCa-скорость» и «рCa-сила» показало, что чувствительность к ионам кальция (pCa50) для кривой «рСа-сила» ниже чем для «рСа-скорость», то есть при снижении концентрации кальция скорость

29

снижается медленнее по сравнению с силой [34]. Можно сделать вывод, что зависимость «рCa-скорость» и «рCa-сила», построенные при помощи метода in vitro Motility Assay аналогичны и обе могут быть описаны с помощью уравнения Хилла [88].

1.2 Региональные особенности миокарда

Сердце млекопитающих можно рассматривать как два насоса, которые работают параллельно: правое предсердие и правый желудочек качают кровь в легочную циркуляцию, и левое предсердие с левым желудочком – в большой круг кровообращения [58]. Все камеры сердца – и желудочки, и предсердия – имеют отличия в структуре и функции, в том числе на уровне сократительных белков [2,3]. Точное понимание структуры сердца является обязательным условием для понимания его функции не только в норме, но и при различных патологиях [14].

1.2.1 Желудочки сердца и их особенности

Левый желудочек является самой большой камерой сердца млекопитающих. Поскольку кровь выталкивается в большой круг кровообращения из левого желудочка, то традиционно многие показатели механической функции сердца рассматриваются только в связи с левым желудочком в норме и при патологии [85]. Возможно, это одна из причин,

почему в прошлом важность функции правого желудочка недооценивалась, и

знания о его роли как в норме, так и при патологии исторически отстают от знаний о левом желудочке [99–101]. Известно, что изменения функции левого желудочка могут быть признаками различных патологий как сердца в целом

[102], так и его отделов, например, правого желудочка [103]. В то же время многие исследования демонстрируют значимость нарушений функции правого желудочка при сердечно-сосудистых заболеваниях [101,104–106].

Правый желудочек перекачивает тот же объем крови, что и левый, но с

25 % работы относительно левого желудочка из-за низкого сопротивления системы легочных сосудов, следовательно, правый желудочек имеет меньший размер, другую форму и более тонкую стенку, в то время как левый желудочек

30