3 курс / Патологическая физиология / АКТИН_МИОЗИНОВОЕ_ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ_В_МИОКАРДЕ_В_НОРМЕ_И_ПРИ_ХРОНИЧЕСКОЙ

5) В камеру добавляли 50 мкл некрашеного F–актина в концентрации 50

мкг/мл в буфере АВ с добавлением 2 мМ АТФ (инкубировали 5 минут). Это нужно для того, чтобы заблокировать неработающие миозиновые головки.

5)Камеру промывали 120-150 мкл буфера AB.

6)В камеру добавляли 50 мкл окрашенного родамин-фаллоидином F–

актина в концентрации 10 нМ в буфере AB (инкубировали 2 минуты).

7) Камеру промывали раствором AB/БСА/ГОК (АВ буфер, 0,5 мг/мл БСА и «кислород-поглощающая система», ГОК: 3,5 мг/мл глюкозы, 0,02 мг/мл каталазы, 0,15 мг/мл глюкозо-оксидазы и 5 мМ 2-меркаптоэтанола), что вело к ригорному соединению тонкой нити с миозином. Добавляли раствор,

состоящий из AB+АТФ/БСА/ГОК.

2.4.5Эксперимент в регулируемым тонким филаментом

Вметоде in vitro Motility Assay регулируемый тонкий филамент реконструировали из актина, тропонина и тропомиозина. Протокол эксперимента в данной модификации отличался тем, что вместо чистого F–

актина в камеру загружался раствор регулируемых тонких филаментов на основе окрашенного родамин-фаллоидином F–актина в буфере АВ, который содержал 100 нМ тропонина и 100 нМ тропомиозина для предотвращения их диссоциации от филаментов. Для инициализации скольжения тонкого филамента по поверхности, покрытой миозином, добавляли финальный раствор, состоящий из AB+АТФ/БСА/ГОК; 100 нМ тропонина; 100 нМ тропомиозина и свободного кальция.

Тестом на хорошее качество собранного филамента являлось отсутствие движения филаментов при добавлении в камеру раствора с АТФ без свободного кальция. В таких условиях актиновая нить начинала двигаться по миозину, регулируемый филамент – нет. При добавлении же раствора,

содержащего АТФ и свободный кальций, наблюдалось скольжение регулируемого филамента по миозину, скорость которого зависела от концентрации свободного кальция в растворе. Так как при низкой концентрации филаментов, загружаемых в камеру, происходит их

72

диссоциация, для предотвращения этой диссоциации в раствор с филаментом добавляли избыточное количество тропонина и тропомиозина. При добавлении в раствор тропомиозина и тропонина в концентрациях 10 нМ в отсутствие ионов кальция и в присутствии АТФ почти все филаменты продолжали двигаться со скоростью, близкой к скорости движения F-актина,

то есть при данной концентрации тропонина и тропомиозина диссоциация тонкого филамента остается высокой. Оптимальной концентрация тропонина и тропомиозина для качественного движения регулируемого тонкого филамента является 100 нМ.

2.4.6 Определение скорости скольжения филаментов

Определение скорости скольжения филаментов осуществлялось с помощью программы GMimPro, разработанной в Национальном институте медицинских исследований (Лондон, Англия) и доступной по адресу в интернете: http://www.mashanov.uk.

В литературе имеется анализ разных подходов к измерению скоростей движения филаментов в искусственных подвижных системах. Все эти подходы дали сравнимые результаты в значениях скоростей движения.

Мы определяли скорости скольжения филаментов следующим образом.

В процессе эксперимента обычно записывали не менее 10 полей из разных частей одной проточной камеры. Длительность записи составляла 10 с,

интервал между кадрами – 300 мс. В каждом поле была измерена скорость как минимум для 10 филаментов, а для каждого филамента был измерен путь длительностью не менее 10 шагов. Для каждого филамента определялась его средняя скорость за время его перемещения и стандартное отклонение. Только те филаменты, которые имели стандартное отклонение средней скорости менее 30 %, использовались для дальнейших расчетов. Распределение скоростей имело вид нормального распределения.

2.4.7 Определение соотношения «рСа-скорость» и «pCa-фракция»

Для определения связи «рСа-скорость» были проведены эксперименты

по определению скорости скольжения реконструированного тонкого

73

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

филамента при различных концентрациях свободного кальция в растворе рабочей камеры от рСа 4,0 до рСа 8,0. Необходимая концентрация свободного кальция достигалась добавлением в финальный раствор, содержащий АТФ,

соответствующего количества CaCl2, которое было рассчитано с помощью доступной в интернете программы WEBMAXC STANDARD (http://www.stanford.edu/~cpatton/webmaxc/webmaxcS.htm). Для построения кривых «рСа-скорость» и «рСа-фракция подвижных филаментов» (фракция – количество движущихся тонких филаментов по миозину от общего их количества) определяли скорость скольжения тонкого филамента по миозину при различных концентрациях свободного кальция в растворе от рСа 4,0 до

рСа 8,0, где рСа – отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция.

Зависимость скорости скольжения тонких филаментов от концентрации кальция анализировалась с помощью уравнения Хилла:

где V и Vmax – скорость и максимальная скорость при насыщающей концентрации кальция, соответственно, pCa50 – это значение pCa, при котором достигается половина максимальной скорости, а h – коэффициент кооперативности Хилла (рис.2).

Рис. 2. Пример кривой «рСа-скорость», построенной с помощью уравнения Хилла методом наименьших квадратов, где Vmax – максимальная скорость, pCa50 – кальциевая чувствительность, h – коэффициент кооперативности Хилла (отражает наклон кривой в точке pCa50).

74

2.5 Статистическая обработка результатов

Первичная обработка данных происходила с помощью специальных программ, таких, как и ImageLab для электрофореза и GMimPro для in vitro

Motility Assay.

Для построения зависимости «рСа-скорость» использовалась скорость,

усредненная как минимум по 100 филаментам для каждого значения рСа.

Зависимость «pCa-скорость» строилась согласно уравнению Хилла с помощью функции сигмоидального анализа Hill в программе OriginPro.

При анализе достоверности различий в значениях всех полученных по-

казателей оценивалась с помощью U-критерия Манна-Уитни, различия считались статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, что вычислялось с помощью простой описательной статистики в программе

OriginPro, STATISTICA и MS Excel.

75

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

(рСа50), не наблюдалось. Кроме того, было проведено сравнение фракции подвижных филаментов – процентного отношения движущихся филаментов к общему их количеству – при насыщающей концентрации кальция в разных отделах сердца (рис.3A, табл.3). Максимальные значения фракции подвижных тонких филаментов по миозину предсердий, правого и левого желудочка сердца крыс не имели значимых отличий, как и такие характеристики зависимости фракции подвижных филаментов от концентрации кальция как кальциевая чувствительность и коэффициент кооперативности Хилла. В то же время видна явная тенденция к снижению фракции подвижных филаментов в правом желудочке.

Вторая экспериментальная серия на другой группе аутбредных крыс показала аналогичные результаты с небольшими отклонениями среднего значения скоростей (рис. 3Б, табл.2): скорость правого и левого желудочков составляла 68 % и 72 % от скорости предсердий. Скорость в левом желудочке была выше, чем в правом, однако, в данной серии эти различия не были статистически значимыми. Кальциевая чувствительность и коэффициент кооперативности Хилла не имели значимых отличий между отделами как для зависимости «pCa-скорость», так и для зависимости «pCa-фракция подвижных филаментов». Само значение фракции подвижных филаментов при насыщающей концентрации кальция также не имело отличий (рис.3Б, табл.3).

Сравнение характеристик актин-миозинового взаимодействия показало,

что две группы крыс различались по всем показателям, кроме коэффициента кооперативности Хилла (табл.2). Однако внутригрупповые характеристики разных отделов имели сходные тенденции: в обеих группах максимальная скорость движения реконструированных филаментов по миозину был выше всего в предсердиях, а скорость в левом желудочке превышала таковую в правом.

77

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Рис. 3. Результаты первой (А) и второй (Б) серии экспериментов. Слева – зависимость скорости движения реконструированного тонкого филамента по миозину из предсердий («A»), правого («RV») и левого («LV») желудочков сердца крыс от концентрации кальция. Справа – зависимость фракции подвижных филаментов по миозину из предсердий («A»), правого («RV») и левого («LV») желудочков сердца крыс от концентрации кальция. рСа – отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция. Линия регрессии соответствует уравнению Хилла.

Таблица 2. Характеристики зависимости «pCa-скорость» в первой (1) и второй (2) серии экспериментов.

* Индекс указывает на значения, имеющие отличия от A – предсердий, RV – правого желудочка, LV – левого желудочка (p<0,05). Данныe прeдставлены как срeднее значeние ± стандартноe отклонeние.

78

Таблица 3. Характеристики зависимости «pCa-фракция подвижных филаментов» в первой (1) и второй (2) серии экспериментов.

* Верхний индекс указывает на значения, имеющие отличия от A – предсердий, RV – правого желудочка, LV – левого желудочка (p<0,05). Данныe прeдставлены как срeднее значeние ± стандартноe отклонeние.

Несмотря на различия характеристик актин-миозинового взаимодействия между двумя исследованными группами крыс, имелись сходные тенденции этих характеристик в разных отделах сердца внутри каждой серии. Миозин разных отделов сердца не имел значимых различий кальциевой чувствительности, коэффициента кооперативности Хилла и характеристик, связанных с фракцией движущихся филаментов. Согласно литературным данным кальциевая чувствительность актин-миозинового взаимодействия в миокарде кролика по быстрому миозину желудочков V1

выше, чем по быстрому миозину предсердий А1 [2], однако, в нашем исследовании значимых различий кальциевой чувствительности не наблюдалось. Это вероятно связано с межвидовыми различиями, поскольку в нашем эксперименте использовались крысы.

Известно, что в предсердиях выше содержание α-ТЦМ с более высокой АТФазной активностью по сравнению с желудочками [12]. Кроме того,

миозины предсердий и желудочков различаются легкими цепями, и АТФазная активность миозина предсердий в 2-3 раза выше, чем соответствующая активность миозина желудочков [55]. Это соответствует нашим результатам обеих экспериментальных серий, где максимальная скорость в предсердиях была примерно в 1,5 раза выше, чем в желудочках.

Интересным фактом было отличие скорости актин-миозинового взаимодействия в левом и правом желудочках в первой экспериментальной серии, и отсутствие значимых различий во второй серии. Возможно, эти отличия объясняются особенностями разных групп аутбредных крыс, и в

79

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

каждой конкретной группе могут быть свои тенденции. В литературе описаны межжелудочковые различия взрослых крыс разных пород в соотношении α- и

β-тяжелых цепей миозина: в правом желудочке выше содержание β-тяжелых цепей миозина по сравнению с левым – около 40 % и 30 %, соответственно,

однако эти различия не всегда значимые [11,107]. Исследования на большом количестве (более 2000) кардиомиоцитов крыс показали, что имеются слабые различия: в правом желудочке на 5– 9% более медленное сокращение и на 3–

15 % более медленная кинетика расслабления по сравнению с клетками левого желудочка [3].

3.1.2Взаимодействие миозина с нативным тонким филаментом

Ввышеописанных экспериментах тонкий филамент был реконструированным, и состоял из скелетного актина кролика, сердечного тропонина свиньи и рекомбинантного сердечного тропомиозина человека.

Однако изучение актин-миозинового взаимодействия с нативным тонким филаментом, экстрагированным из того же сердца, что и миозин также представляет несомненный интерес, несмотря на сложность работы с ним.

Для исследования контрактильных характеристик миокарда на молекулярном уровне мы провели серию экспериментов, в которых по миозину двигались нативные тонкие филаменты, экстрагированные из того же отдела сердца той же крысы, что и изучаемый миозин.

Несмотря на то, что АТФазная активность миозина различна для предсердий и желудочков, скорость движения нативных филаментов по миозинам в разных отделах не отличается (рис.4, табл.4). Максимальная скорость для предсердий в данном случае была 3,7±0,3 мкм/с, для правого желудочка – 3,6±0,2 мкм/с и для левого – 3,7±0,3 мкм/с. В то же время скорость скольжения реконструированного тонкого филамента по миозину тех же самых крыс составляла 5,2±0,2 мкм/с для предсердий, 3,6±0,2 мкм/с для правого и 3,9±0,2 мкм/с для левого желудочка.

80