3 курс / Патологическая физиология / АКТИН_МИОЗИНОВОЕ_ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ_В_МИОКАРДЕ_В_НОРМЕ_И_ПРИ_ХРОНИЧЕСКОЙ

(ротор TLA 120.1, центрифуга OPTIMA TLX Beckman Coulter). Осадок тщательно промывали буфером №1 и перерастворяли в этом же буфере в соотношении 3 мл буфера на 1 г первоначального веса ацетонового порошка.

Для деполимеризации актин диализовали против буфера №1 в течение

24 часов. Для осаждения недеполимеризовавшегося актина раствор центрифугировали в течение 1 часа при 300 000 g. Затем актин замораживали жидким азотом небольшими порциями и хранили при -20 С не более 6

месяцев.

Актин полимеризовали, повышая концентрацию КСl до 50 мМ, MgСl2

до 1 мМ, АТФ до 1 мМ в растворе. Температура раствора 4 С. Время полимеризации не менее 1 часа. Для получения меченого актина использовали тетраметилродамин-фаллоидин (Sigma-Aldrich Company Ltd.), который растворяли в метаноле до 4 мкМ и замораживали порционно.

Свежеприготовленный филаментарный актин разводили до концентрации 2

мкМ и добавляли в размороженную пробирку с тетраметилродамин-

фаллоидином (ТМРФ). Полученный раствор оставляли на 12-20 часов для окраски F-актина при 4 °С. При хранении при температуре 4-8 °С меченый актин использовался в течение нескольких месяцев.

2.2.3 Получение тропонина

Растворы и буферы для получения тропонина

Состав буфера №1: 1M KCl, 25 мM Tris-HCl (pH 7,0), 0,1 мM ДTT.

Состав буфера №2: 10 мM имидазола (pH 7,0), 50 мM KCl, 0,1 мM CaCl2, 0,1 мM ДTT, 0,02 % NaN3.

Методика получения тропонина

Сердечный тропонин экстрагировали как комплекс трех субъединиц, включая тропонин I, тропонин C, тропонин T. В нашей экспериментальной работе мы выделяли тропонин сердца свиньи из ацетонового порошка по методу Potter [187] с небольшими модификациями. Из левого желудочка сердца свиньи сначала получали ацетоновый порошок по методике, которая используется при получении актина (описана выше). Из ацетонового порошка

61

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

тропонин экстрагировали в течение двух часов в буфере №1 в соотношении

1:20 (w/v). Затем экстракт центрифугировали в течение 20 минут при 10000 g. Осадок снова растворяли буфере №1 в соотношении 1:7,5 (w/v) и повторяли центрифугирование в течение 10 мин при 11000 g. Значение pH объединенного супернатанта повышали до 8,0 с помощью 1 М KOH и затем в раствор добавляли сульфат аммония до концентрации 30 % от насыщения (167 г соли на 1 л) медленно в течение 1 часа при постоянном перемешивании и поддержании нужного значения рН. Затем снова центрифугировали в течение

15 мин при 11000 g, и в полученный супернатант медленно в течение 1 часа добавляли сульфат аммония до концентрации 42,5 % насыщения при постоянном перемешивании (73 г (NH4)2SO4 на 1 л раствора). При этом значение pH поддерживали в пределах 7,0-8,0. Полученную смесь центрифугировали в течение 15 минут при 11000 g. Осадок сердечного тропонина растворяли в минимальном объеме буфера №2 и диализовали в течение 12 часов против этого же буфера.

После диализа тропонин замораживали небольшими порциями в жидком азоте и хранили при температуре -86 ºС. Все операции при получении тропонина проводились при температуре 4 ºС. Тропонин использовался в течение 4 месяцев. Хроматографическая очистка не применялась, поскольку она уменьшает стабильность тропонина.

2.2.4 Получение сердечного тропомиозина

Растворы и буферы для получения тропомиозина

Состав лизис-буфера: 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 15% сахароза, 1 мМ PMSF, 1 мМ EDTA.

Методика получения тропомиозина

В нашей экспериментальной работе мы использовали рекомбинантный человеческий тропомиозин дикого типа – гомодимер αα. Использование сократительных и регуляторных белков, полученных из разных видов млекопитающих является распространенной практикой в исследовании механики взаимодействия регуляторных и сократительных белков.

62

Рекомбинантный человеческий тропомиозин был экспрессирован в клетках E. coli штамма C41(DE3). Трансформацию «химически» компетентных клеток проводили плазмидой pMW172 или pJC20 и затем высевали трансформантов на чашки со средой LB-агар, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. После этого одиночные колонии инокулировали в 15 мл стерильной среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и оставляли на ночь на шейкере при 37 ºС и 234 об/мин. Далее, 15 мл ночной культуры добавляли в 1 литр среды LB (содержащей 100 мкг/мл ампициллина) и оставляли клетки расти на шейкере до величины оптической плотности при 600 нм, равной 0,8–1,2 (~ 3 часа). К среде добавляли индуктор экспрессии изопропилтиогалактозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и продолжали экспрессию в течение 3–4 часов. Осадок клеток собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 1 часа при 4 ºC, а затем ресуспендировали в лизис-буфере. Полученные клетки замораживали и хранили при -70ºС до момента выделения и очистки методом ионной хроматографии. Концентрацию тропомиозина определяли спектрофотометрически, затем препараты белка замораживали и хранили при

-70ºC [188].

2.2.5 Реконструкция регулируемого тонкого филамента

Растворы и буферы для реконструкции тонкого филамента

Состав буфера №1: 25 мМ KCl, 25 мM имидазола, 4 мM MgCl2, 1 мM

EDTA, 10 мM ДTT (pH 7,5).

Методика реконструкции регулируемого тонкого филамента

Тонкий филамент реконструировали путем смешивания актина,

тропонина и тропомиозина в следующих концентрациях: 400 нМ F-актина,

окрашенного родамин-фаллоидином, 80 нМ тропонина и 100 нМ тропомиозина при 4 ºС в буфере №1. Время инкубации тонкого филамента составляло 15-30 минут. Проверка содержания актина, тропонина и тропомиозина в тонких нитях проводилась с помощью SDS-PAGE по Laemmli [189].

63

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

2.2.6 Получение нативного тонкого филамента

Растворы и буферы для получения нативного тонкого филамента

Состав буфера №1: 10 мМ КРО4 (pН 7,0), 100 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 1

мМ ЕGТА, 1 мМ NaN3, 1 мМ ДТТ, 1 % Тriton Х-100, 0,01 мг/мл фенилметилсульфонил флюорид, 0,001 мг/мл леупептин, 0,001 мг/мл пепстатин и 0,001 мг/мл антипаин.

Состав буфера №2: 25 мМ имидазол, 100 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЕGТА, 0.2 мМ АТФ, 1 мМ NaN3, 10 мМ ДТТ (рН 7,5).

Методика получения нативного тонкого филамента

Нативный тонкий филамент был экстрагирован из ткани разных отделов сердца крыс в соответствии с протоколом Spiess [190]. Ткань гомогенизировали с 4-кратным объемом буфера №1 и центрифугировали в течение 10 мин при 22500 g. Затем осадок гомогенизировали в этом же буфере, но без triton Х-100 и центрифугировали в течение 10 минут при 22500 g, это шаг повторялся 3 раза. После третьего центрифугирования для диссоциации толстых и тонких филаментов осадок гомогенизировали в этом же буфере с добавлением 5 мМ АТФ в соотношении 1:1,6 объемах и центрифугировали в течение 10 мин при 22500 g. Затем для осаждения тонких филаментов супернатант центрифугировали в течение 60 мин при 300000 g. Осадок, содержащий преимущественно тонкие филаменты, ресуспендировали в 25 мл буфера №2 и диализовали против этого же буфера в течение ночи. На следующий день раствор с нативным филаментом центрифугировали 10 мин при 22500 g для удаления агрегатов и измеряли концентрацию. Для окрашивания использовали тетраметилродамин-фаллоидин (Sigma-Aldrich Company Ltd.), который растворяли в метаноле. Свежеприготовленный тонкий филамент разводили до концентрации 5 мкМ и добавляли в приготовленную пробирку с тетраметилродамин-фаллоидином. Данный раствор выдерживали в течение 1 часа при температуре 4 °С до полного окрашивания. Тонкий филамент использовался в течение дня.

64

2.2.7 Определение концентрации белков

Концентрацию миозина, актин, тропонина, тропомиозина и нативного тонкого филамента определяли после выделения из мышечной ткани с помощью спектрофотометра. Концентрацию миозина вычисляли по разнице поглощения на длинах волн 280 и 340 нм (коэффициент поглощения 0,53 см- 1), концентрацию актина – по разнице поглощения раствора на длинах волн

290 и 310 нм (коэффициент поглощения 0,62 см-1). Для вычисления концентрации тропонина и тропомиозина использовали коэффициенты поглощения 0,45 см-1 и 0,29 см-1, соответственно, на длине волны 276 нм. Для определения концентрации нативного тонкого филамента использовали коэффициент поглощения 0,0259 см-1 при длинах волны 280 и 340 нм.

2.3 Электрофоретическое разделение белков

2.3.1 Проверка состава тяжелых цепей миозина

Буферы и растворы для проверки состава тяжелых цепей миозина

Состав раствора для разделяющего геля: 8% полиакриламида 50:1, 0,375

М буфера Tris-HCl (рН 8,8), 10 % глицерола, 0,1 % w/v додецил сульфата натрия (SDS), 0,1 % w/v персульфата аммония (APS), и 0,07 % v/v TEMED,

деионизированная H2O (до объема 10 мл).

Состав концентрирующего геля: 4% полиакриламида 50:1, 0,14 М

буфера Tris-HCl (рН 6,8), 10 % глицерола, 0,25 % SDS, 6 мМ w/v

этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 0,1% APS, 0,01% TEMED,

деионизированная H2O (до объема 4 мл).

Состав буфера для образцов: 625 мМ Tris-HCl, (pH 6,8), 15 мМ дитиотреитола (ДТТ), 1 % SDS, 0,01 % бромфенолового голубого красителя, 15 % глицерола.

Состав буфера для проведения электрофореза: 50 мМ Tris, 75 мМ глицина, 0,05 % w/v SDS и 0,07 % β-меркаптоэтанола.

Методика проверки состава тяжелых цепей миозина

Состав изоформ тяжелых цепей миозина из миокарда разных отделов

(предсердий, правого и левого желудочков) сердца крыс мы определяли с

65

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

помощью вертикального денатурирующего полиакриламидного гель-

электрофореза с додецил сульфатом натрия по методу Reiser & Kline [191] с

незначительными модификациями.

В наших экспериментальных исследованиях мы использовали мини-

гели размерами 100×120×0,75 мм. Концентрация полиакриламида была 8 %

для разделяющего (нижнего) геля и 4 % – для концентрирующего (верхнего)

геля при соотношении акриламида к бисакриламиду – 50:1.

Раствор разделяющего геля заливался в установку из чистых стекол,

сверху добавлялось 120 мкл изопропанола для выравнивания и во избежание испарения геля. Полимеризация происходила в течение 30-40 минут.

Раствор концентрирующего геля заливался в установку поверх предыдущего геля с предварительной промывкой от изопропанола, сверху вставлялись специализированные «гребенки» для создания «кармашков».

Полимеризация концентрирующего геля происходила в течение 20-30 минут.

Пробы миозина растворялись в буфере для образцов. Концентрация миозина в буфере составляла 0,1 мг/мл. В каждый кармашек загружалось по

3-7 мкл полученного раствора. Перед погружением в кармашки раствор белка нагревали в течение 3 минут при температуре 85 ºС.

Для проведения электрофоретического разделения использовали специальный буфер для электрофореза против того же буфера, разведенного в два раза. Электрофорез проводился при постоянном напряжении 100 мВ в течение 40 минут и далее при 160 мВ в течение 6 часов при температуре 8 °С.

Также использовался альтернативный вариант при постоянной силе тока 15

мА в течение 40 минут, и затем 25 мА в течение 3 часов при температуре 8 ºС.

По окончании электрофореза гель промывали водой трижды по 5 минут.

Окрашивание проводили с помощью краски Кумасси (Coumassie Brilliant Blue). Далее гель отмывали в растворе, содержащем 20 % этилового спирта

(C2H5OH) и 10 % уксусной кислоты (CH3COOH).

После завершения этапа отмывания гели сканировали с помощью денситометра и программного обеспечения TDS Quantity (BioRad).

66

Процентное соотношение α- и β-ТЦМ определяли с помощью

специализированного программного обеспечения Image Lab 5.2.1 (BioRad).

2.3.2 Оценка чистоты актина, тропонина и тропомиозина

Оценку чистоты актина и регуляторных белков проводили с помощью

денатурирующего полиакриламидного гель электрофореза c додецил

сульфатом натрия (SDS-PAGE) по методике Laemmli [189].

2.3.2 Определение уровня фосфорилирования белков

Определение уровня фосфорилирования белков происходило с помощью набора Pro-Q Diamond Phosphoprotein Blot Stain Kit (Invitrogen) и

окрашивания краской Sypro Ruby (Sigma Aldrich).

Стоковые растворы необходимо готовить, используя чистую демонизированную воду, и хранить при комнатной температуре не более 6

месяцев (кроме фиксирующего раствора, который следует готовить свежим перед каждым использованием):

– Фиксирующий раствор – 50 % этанола и 10 % уксусной кислоты. 200

мл фиксированного раствора на минигель (8 см × 8 см × 1 мм).

– Отмывающий раствор – 20 % ацетонитрила, 50 мМ ацетата натрия, pH 4,0. Для одного минигеля требуется 200 – 300 мл раствора.

Для разделения белков с помощью электрофореза и последующего окрашивания с помощью Pro-Q Diamond необходим делипидированный и обессоленный образец. Для образца объемом 150 мкл (~ 150–300 мкг белка)

добавить 600 мкл метанола и тщательно перемешать, затем добавить 150 мкл хлороформа. После тщательного перемешивания добавить 450 мкл чистой деионизированной воды и хорошо перемешать. Полученный раствор центрифугировать при ~12000 об/мин в течение 5 минут. После этого аккуратно удалить верхнюю фазу и забрать для последующего использования белый осадочный диск, который образуется между верхней и нижней фазами.

К полученному осадку добавить 450 мкл метанола и тщательно перемешать,

затем центрифугировать при ~12000 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования удалить супернатант и высушить осадок в вакуумной

67

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

центрифуге в течение 10 минут. Готовый осадок ресуспендировать в стандартном буфере для электрофореза.

Следующим шагом необходимо разделить белки, используя стандартные методы электрофореза в полиакриламидном геле. Чтобы обеспечить обнаружение менее распространенных фосфопротеинов,

необходимо использовать примерно ту же массу белка, как для типичного геля при окрашивании Кумасси.

Затем нужно погрузить гель в ~100 мл заранее приготовленного фиксирующего раствора и инкубировать при комнатной температуре при осторожном перемешивании не менее 30 минут. Повторить этап фиксации еще раз, чтобы убедиться, что гель промыт от додецилсульфата натрия. Гели можно оставить в растворе для фиксации на ночь.

На следующий день гель нужно инкубировать в ~100 мл деионизированной воды, осторожно перемешивая в течение 10 минут. Гель погружается в воду, чтобы удалить из него весь метанол и уксусную кислоту,

так как остаточный метанол или уксусная кислота будут мешать окрашиванию. Этот шаг необходимо повторить трижды.

Для окрашивания инкубировать гель в объеме фосфопротеина Pro-Q

Diamond, эквивалентном 10-кратному объему геля, аккуратно перемешивая в темноте в течение 60–90 минут. При непосредственном сравнении нескольких гелей важно, чтобы время инкубации было одинаковым для каждого геля.

Для отмывания гель нужно инкубировать в 80–100 мл заранее приготовленного отмывающего раствора, перемешивая в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Повторить эту процедуру три раза в общей сложности. Оптимальное общее время отмывания составляет около 1,5 часов. Далее гель инкубируют в деионизированной воде при комнатной температуре в течение 5 минут.

После отмывания водой гель сканируют и файлы сохраняются в памяти компьютера. Окрашивание с помощью фосфопротенина Pro-Q Diamond имеет максимум поглощения при ~555 нм и максимум излучения при ~580 нм.

68

После получения результатов с Pro-Q Diamond, гель необходимо окрасить для определения общего содержания белка. Окрашивание геля с помощью SYPRO Ruby является наиболее точным и позволяет определить относительное состояние фосфорилирования данного белка.

Перед окрашиванием гель промывают в деионизированной воде два раза по 5 минут каждый (не обязательно, если гель уже был промыт водой) и

инкубируют гель непосредственно в растворе красителя SYPRO Ruby в

течение 3 часов, затем инкубируют в отмывающем растворе три раза по 30

минут. Далее гель сканируют на общее содержание белка, а результаты подсчитывают с помощью программы ImageLab.

2.4Метод in vitro Motility Assay

2.4.1Краткое описание метода in vitro Motility Assay

Методика исследования механической функции белков – in vitro

подвижная система (in vitro motility assay) – реализована в лаборатории биологической подвижности ИИФ УрО РАН и является уникальной в России.

Этот метод позволяет исследовать характеристики взаимодействия сократительных и регуляторных белков на уровне ансамбля молекул.

Используемый в экспериментальной работе миозин фиксировали на внутренней поверхности проточной камеры, которая заранее покрыта раствором нитроцеллюлозы в амилацетате. В проточную камеру помещается раствор с F-актином, окрашенный родамин-фаллоидином – флуоресцентным красителем. Проточную камеру устанавливали на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа. При взаимодействии актина и миозина образуется ригорный комплекс – флуоресцентно окрашенные актиновые филаменты укладываются на поверхности, что позволяет настроить фокус объектива именно на эту поверхность. С помощью интенсифицированной видеокамеры, установленной на флуоресцентном микроскопе, регистрируется изображение актиновых или тонких филаментов.

При добавлении в камеру АТФ-содержащего раствора, актин двигается по поверхности миозина. Видеозапись двигающихся нитей филаментарного

69

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

актина производится на жесткий диск компьютера с помощью специализированного программного обеспечения. Этот метод позволяет измерять скорость скольжения актиновых нитей по миозину. Таким образом,

происходит исследование взаимодействия сократительных и регуляторных белков на уровне ансамблей молекул.

2.4.2Структура проточной камеры

Вэкспериментах с искусственной подвижной системой (in vitro Motility Assay) использовали заранее подготовленные проточные камеры, которые конструировали следующим образом: на предметном стекле фиксировали две тонких полоски двухстороннего скотча шириной не более 5 мм и толщиной не более 0,1 мм. Поверх приклеенных полосок фиксировалось покровное стекло,

которое с внутренней стороны было покрыто 1 мкл 0,05 % раствора нитроцеллюлозы в амилацетате с выдержкой не менее 2 минут.

2.4.3 Экспериментальная установка

Экспериментальная установка (рис.1) включает в себя:

инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп (Axiovert 200 М, Carl Zeiss MicroImaging GmbH), ртутную лампу HBO 100 и набор специальных фильтров

(Filter Set 20; Carl Zeiss) для тетраметилродамина. Узкополосный зеленый фильтр 1 выделяет из излучения ртутной лампы свет с длиной волны 546 нм для возбуждения флуоресценции тетраметилродамина, который отражается в объектив дихроическим зеркалом. Флуоресценция тетраметилродамина на длине волны 575 нм проходит через дихроическое зеркало и дополнительно фильтруется эмиссионным фильтром 2.

Изображение флуоресцентно окрашенного F-актина регистрировалось с помощью EMCCD видеокамеры iXon-897BV (Andor Technology). Для экспериментов использовался масляно-иммерсионный объектив Alpha PlanFluar 100×1,45 NA (Carl Zeiss). Для последующей обработки изображение записывали на жесткий диск компьютера с помощью программного обеспечения GMimPro.

70