Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвению соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фагам.

Этапы:1.Исследование материала -забор, регистрация

-ориентировочная микроскопия с окраской мазка.-посев смеси бактерий на пластинчатый агар. 2.Изучение колоний

-изучениекультуральных свойств (величина, форма, консистенция, поверхность, край, наличие пигмента, цвет, прозрачность)-микроскопия с окраской.

-посев колонии на скошенный агар.

3.Изучение чистой культуры - микроскопия с окраской – морфологически и тинкториально однородные

клетки идентификация биохимическая – посев в «пёстрый» ряд фагоидентификация сероидентификация Микробиологический метод включает в себя выделение чистой культуры и её идентификацию.

Этапы исследования:

1.Приготовить мазок из бактериальной смеси. Окрасить по Грамму. Микроскопировать, определить морфотип и их грамм-принадлежность. Для получения изолированных колоний (чистых культур) выполнить посев на МПА в чашку Петри с помощью шпателя.

2.Изучить рост на МПА, определить количество типов выросших колоний. Изучить и описать типичные колонии. Выбрать «подозрительную» колонию, часть материала из которой используют для приготовления мазка, окрашенному по Грамму. При обнаружении в нем грамотрицтельных палочек, оставшуюся часть колонии пересеять на скошенный агар для накопления биомассы и поддержания культуры в чистоте.

3.Проверить выделенную культуру на чистоту. С целью идентификации выполнить посев чистой культуры на среды короткого «пестрого ряда» (лактоза-, манит-, глюкоза-, 1% пептонная вода-). Для оценки спектра антибиотикочувствительности выполнить «газонный посев» разложить диски с антибиотиками(цефуроксин, пиперациллин, цефоперазон, стрептомицин, мономицин). Для оценки фаголизабельности нанести на газооный посев диагностический бактериофаг кишечной палочки E.coli.

4.Оценить результат идентификации тестов и спектр антибиотикочувствительности выделенной культуры, определить антибиотик выбора.

Student TJ

Дыхание бактерий – это процесс переноса атомов водорода о цепи дыхательных ферментов, в результате которого вырабатывается энергия.

По типу дыхания выделяют:

1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.

2.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях.

3.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен.

Классификация бактерий по типу дыхания - биологического окисления.

По потребности микроорганизмов в кислороде выделяют пять групп:

1.Облигатные (строгие) аэробыспособны получать энергию только путем дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярном кислороде. Энергию получают окислительным метабо лизмом, используя кислород как терминаль ный акцептор электронов в реакции, катали зируемойцитохромоксидазой. Пример: представители родовPseudomonas

иBacillus.

2.Облигатные (строгие) анаэробыне способны расти и размножаться в присутствии кислорода, поскольку у них отсутствуют ферменты, расщепляющие токсические соединения кислорода.Для них как тип окисли тельновосстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору. Тип метаболизма у них — бродильный. Пример: микроорганизмы родовClostridiumи Bacteroides.

3.Факультативные анаэробы способны расти и размножаться как в при сутствии кислорода, так и в его отсутствии.Они обладают смешанным типом метабо лизма и могут использовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения. Процесс получения энергии у них мо жет происходить кислородным дыханием в присутствии кислорода, а в его отсутствиипереключаться на брожение. Пример:

Escherichia coli и Saccharomyces.

4.Микроаэрофилынуждаются в низком содержании свободного кислорода 2-10%. Естественной средой обитания микроаэрофилов является мукозный слой, покрывающий эпителий желудка, где концентрация кислорода невелика. У микроаэрофилов имеются ферменты, которые инактивируются при контакте с сильными окислителями иактивны только при низких значениях парци ального давления кислорода, например фер мент гидрогеназа. Многие микроаэрофильные бактерии растут быстреев избыточном количестве углекислого газа (до 20%),

поэтому их называют капнофилами.Пример: Helicobacter pylori, Campylobacter.

5.Аэротолерантные микроорганизмы способны расти в присутствии атмосферного кислорода, но не использовать его в качестве источника энергии. Они осуществляют анаэробный метаболизм (брожение), но устойчивы к действию кислорода при его обычных концентрациях.

Пример: Streptococcus pyogenes, Lactobacillus.

Методы культивирования анаэробов:

Механические методы:

1.Посев уколом в столбик сахарного агара.

2.Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносятисследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов

— анаэробов.

3.Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическимраствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла

вырастают анаэробы.

Физические методы:

1.Анаэростат — создание вакуумных условий.

2.Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3.Среда Китта-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокойадсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

Химические методы:

1.Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пирогаллол.

2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернистокислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.

Биологический метод Фортнера:

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну половину засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

Student TJ

Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов и риккетсии. (учебно-методическое пособие)

Введение

В настоящее время ведущая роль в этиологии инфекционных болезней человека и животных принадлежит вирусам.

Диагностика вирусных болезней осуществляется на основании эпизоотологических, клинических, паталогоанатомических данных, а также результатов лабораторных исследований. Эпизоотологические сведения и клинико-паталогоанатомические данные позволяют поставить лишь предварительный диагноз. Окончательный диагноз большинства вирусных болезней ставится на основании лабораторных исследований. Основные методы лабораторной диагностики вирусных болезней:

·Вирусоскопическое исследование с целью обнаружения вирусов в исследуемом материале с помощью электронной микроскопии вирионов или светооптических микроскопов внутриклеточных включений;

·Вирусологическое исследование – выделение чистых культур вирусов с использованием культур клеток или куриных эмбрионов, с последующим их типированием.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ

Основные методы культивирования вирусов. 1.В организме лабораторных животных.

2.В куриных эмбрионах.

3.В клеточных культурах.

Использование лабораторных животных

В настоящее время лабораторные животные широко применяются в вирусологии для решения самых разнообразных теоретических и практических вопросов.

Большинство вирусов могут быть дифференцированы друг от друга на основании патогенности для различных видов животных. Некоторые вирусы не представляется возможным культивировать ни в куриных эмбрионах, ни в культуре клеток, а только в организме восприимчивых животных.

Наличие у лабораторных животных характерной клинической картины после заражения патологическим вируссодержащим материалом, результаты вирусологических и гистологических исследований их органов и тканей в ряде случаев являются основным методом диагностики вирусных болезней человека. Заражают белых мышей, кроликов, морских свинок, крыс и т.д.

Методы заражения: оральное, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, внутривенное заражение, в брюшную полость, интракардиальное заражение, заражение через нос, заражение в мозг.

Оральное заражение (per os). Для заражения вируссодержащий материал добавляют к пище или воде. Реже через носоглоточный зонд.

Заражение в мозг. Интрацеребральную инъекцию у большинства лабораторных животных производят сбоку от средней линии, в середине между верхним краем глазной впадины и наружным слуховым проходом. Животных заражают путем прокола кости черепа иглой. Материал вводят в количестве 0,2-0,3 мл, медленно.

Использование куриных эмбрионов

В вирусологической практике куриные эмбрионы нашли широкое применение для выделения вируса из патологического материала. Существенное преимущество этого метода – высокая бактериологическая чистота получаемых вирусных суспензий, так как замкнутая полость яйца служит надёжной защитой от различной микрофлоры. Куриные эмбрионы пригодны для культивирования многих вирусов, патогенных для человека и животных. Они дёшевы, удобны и доступны для работы большинства практических лабораторий.

К недостаткам этого метода относятся высокое содержание в экстраэмбриональных вирусосодержащих жидкостях неспецифического белка, а также возможность спонтанного инфицирования куриных эмбрионов вирусами.

Для вирусологических исследований используют яйца, полученные из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц. Для инкубации яйца помещают в специальные инкубаторы с температурой 37,5-38 С и относительной влажностью воздуха 40-70%. Продолжительность инкубирования куриных эмбрионов определяется избранным методом введения вируссодержащего материала. Чаще всего в работе используются 7-12-дневные куриные эмбрионы.

Строение куриного эмбриона.

Развитие оплодотворенного яйца начинается с образования трёх зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Из экто- и мезодермы возникает амниотическая полость. Амниотическая полость заполнена жидкостью (1мл).

Из экто- и мезодермы кроме амниона образуется хорион, который к 10-му дню обволакивает все содержимое яйца, образуя периферическую поверхность хориоаллантоисной оболочки. Внутренняя поверхность аллантоисной оболочки образуется из энтодермы на 3-й день развития эмбриона. Пространство между хориоаллантоисной и аллантоисной оболочкой, покрывающей амнион, заполнено аллантаисной жидкостью. Основной резервуар питательных веществ для зародыша – желточный мешок.

Методы заражения куриных эмбрионов.

Выбор методов заражения куриных эмбрионов зависит от биологических свойств исследуемого вируса. В вирусологической практике широкое применение нашло заражение на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость и в желточный мешок.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку.

Используют 10-12 – дневные куриные эмбрионы, инкубированные в горизонтальном положении. Поверхность яйца дезинфицируют спиртом, 2% раствором йода, прожигают. На скорлупе выпиливают треугольник (5-6мм). Иглой надрывают подскорлупную оболочку. На обнажённую хорионаллантоисную оболочку пастеровской пипеткой наносят 0,1 мл вируссодержащего материала. Отверстия на скорлупе закрывают парафином.

Заражение в аллантоисную полость.

Используют 9-11 – дневные эмбрионы, когда аллантоисной жидкости содержится больше всего. Скорлупу дезинфицируют спиртом, 2% раствором йода, прожигают. Яйцо помещают вертикально тупым концом вверх. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы и через него вводят иглу диаметром 0,5 мм и длиной 5 см на глубину 3-5 см. Инокулируют исследуемый материал в количестве 0,1 мл. Место инъекции закрывают парафином. Яйца инкубируют в вертикальном положении при 35 С 24-72 ч.

Заражение в амниотическую полость.

Используют 10-11-дневные эмбрионы, которые близко расположены к воздушному пространству. Заражение производят в затемненном помещении под овоскопом. Тупой конец яйца дезинфицируют, в скорлупе делают отверстие над воздушной камерой. Для заражения используют иглу диаметром 0,6мм. Материал вводят в количестве 0,1 мл. Отверстие закрывают парафином. Зараженные яйца инкубируют при 37С 24-72ч.

Заражение в желточный мешок.

Используют 5-6-дневные эмбрионы, т.к. в этот период желточный мешок имеет самый большой объем. Скорлупу дезинфицируют, делают в ней отверстие. Для заражения используют иглу длиной 5см, которую вводят вертикально до упора. Игла прокалывает хорионаллантоисную оболочку, проходит через аллантоисную полость и через стенку желточного мешка в желток. Место инъекции закрывают парафином. Яйца инкубируют при 37С 72 ч.

Использование клеточных культур

Культуры клеток – это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам.

Для выращивания клеточных культур необходимы среды, которые должны иметь солевой состав, близкий клеткам организма, определенное значение pH, содержать питательные вещества и факторы роста. Первые питательные среды состояли из плазмы, сыворотки крови, эмбрионального экстракта и др. Эти биологические компоненты используют и в настоящее время. Основой всех современных сред являются сбалансированные солевые растворы Хэнкса и Эрла. Питательные среды для культур клеток разделяются на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды в отличии от поддерживающих содержат сыворотку крови.

Питательные среды по происхождению делят на естественные и искусственные.

Естественные – это ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов (гидролизат лактальбумина, казеина, гемогидролизат и др.). Синтетические среды получают добавлением к солевым растворам аминокислот, витаминов (среда 199, среда Игла).

В диагностической работе вирусологических лабораторий широко применяются следующие клеточные культуры: первично-трипсинизированные, перевиваемые и полуперевиваемые.

Если первичную ткань пересевают в свежую питательную среду (т.е. производят пассаж) и в ней образуется рост культуры, т.е её называют тканевой субкультурой. Практически субкультуры удаётся получить из любой первичной ткани, но количество пассажей ткань выдерживает не больше 4-5, редко до 20. В результате подбора специальных питательных сред, режима пассажирования удается адаптировать отдельные ткани к определенной питательной среде и пассажировать их (перевивать) очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассажированию называются перевиваемыми.

Первично-трипсинизированные культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток – это растущие однослойные культуры клеток, полученные посредством ферментативной дезагрегации органов и тканей. Первичные культуры

получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

Недостатком первично-трипсинизированных культур является трудоемкость и длительность их получения, а также частая контаминация латентными вирусами. Выбор органа и ткани зависит от чувствительности их клеток in vitro к исследуемому материалу. В вирусологической практике нашли применение первично-трипсинизированные культуры фибробластов мышей, эмбрионов человека, эмбрионов кур, почек морской свинки.

Перевиваемые культуры клеток.

Перевиваемые культуры клеток получают из необластических и нормальных тканей и органов человека или животных. Они имеют измененный кариотип и обладают способностью бесконечно перевиваться in vitro.

Перевиваемые культуры клеток в сравнении с первично-трипсинизированными обладают существенными преимуществами: способностью неопределённо долгое время перевиваться, высокой интенсивностью размножения, простой техникой культивирования, возможностью использования сходных штаммов в различных лабораториях, отсутствием инфицированности посторонними вирусами. Многие перевиваемые культуры проведены через сотни серийных пассажей, имеют совершенно одинаковую форму клеток, стабильны в условиях in vitro, что делает их особенно пригодными для выполнения различных экспериментальных исследований. Перевиваемые культуры клеток Hela, Hep-1, Hep-2, почка эмбриона свиньи, почка эмбриона коровы и другие используются для выделения вируса из патологического материала. Перевиваемые культуры выращивают в виде суспензии или однослойных культур на поверхности стекла в культурных сосудах.

Перевиваемые клетки легче получать из злокачественных тканей (клетки Hela получены из карциномы шейки матки женщины, клетки Hep-2 из карциномы гортани человека идр.), но в настоящее время широко культивируются перевиваемые клетки «нормальных» тканей. Однако существует мнение, что перевиваемые ткани «нормального» происхождения вследствие приобретённой потенциальной возможности к бесконечному размножению перерождаеются.

В вирусологической практике перевиваемые ткани имеют некоторые преимущества: они свободны от скрытых вирусов, тогда, как первичные ткани могут быть носителями латентного вируса; обладают более широким спектром чувствительности к разным вирусам; кроме того, детально изучена их морфология и чувствительность к различным вирусам.

Но перевиваемые клетки имеют ряд недостатков, которые ограничивают в известной степени их применение: они склонны к малигнизации, т.е. к злокачественному перерождению независимо от их происхождения; необходимость постоянного поддержания их; у них появляется неспецифическая дегенерация, изменяется морфология клеток и снижается чувствительность к вирусам. В последние годы в вирусологии, особенно в биопромышленности, применяют штаммы клеток с диплоидным набором хромосом, так называемые диплоидные клетки. Такие штаммы клеток сохраняют хромосомный набор, типичный для исходных тканей. Диплоидные клетки обладают чувствительностью к вирусам, как исходные клетки, свободны от латентных вирусов и не обладают канцерогенными свойствами. Недостаток диплоидных клеток – ограниченная возможность их пассажирования.

Получение субкультур или перевивание клеток проводят следующим образом.

Снятие клеточного слоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путём (соскоб), или воздействием 0,02% раствора версена, или 0,25% раствором трипсина.

Из сосудов с выросшим клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют в них подогретый до 37С раствор версена (в количестве вдвое меньшем, чем было среды) и выдерживают в термостате 20-30 минут, при этом сосуд несколько раз покачивают. Версен связывает двухвалентные катионы магния и кальция, в результате ткань разделяется на отдельные клетки и отслаивается от стекла.

Отделение клеток от диспергирующего вещества. Взвесь клеток в диспрегирующем веществе

(в версене) помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800-1000об/мин в течение 7-10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Затем берут 1-2 мл клеточной взвеси и подсчитывают клетки.

Посев клеток. После подсчёта клеток в 1 мл исходную клеточную взвесь разводят питательной средой до нужной концентрации. При этом учитывают добавление к общему объему среды стерильной сыворотки крупного рогатого скота в количестве 10%. Подготовленную взвесь вносят при помешивании в специально подготовленную для культивирования клеток посуду и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток в пробирке по 80-100 тыс. в 1 мл; в сосуды с плоской поверхностью – 25-30 тыс. на 1 см полезной площади сосуда.

Засеянные клетки выращивают в термостате при температуре 37С в течение 3-4 суток. Перевиваемые штаммы клеток обычно пересеваются через каждые 6-7 дней.

Заражение клеточных культур вирусом. Проводят в стерильном боксе. Перед заражением все клеточные культуры микроскопируют и отбирают пробирки или матрацы только с хорошим, типичным монослоем. Культуры с неполным монослоем, с признаками дегенерации клеток или с нетипичным клеточным ростом бракуют.

В качестве вируссодержащего материала для заражения клеток используют фильтраты (прошедшие через бактерийный фильтр) или свежевзятый (в стерильных условиях) нативный материал с добавлением антибиотиков. Заражать ткани можно пассажным вирусом на культуре ткани. В этом случае используют от культур с типичным для данного вируса цитопатогенным эффектом.

Методика заражения. Из отобранных культур отсасывают или сливают питательную среду. Часть культур (не менее четырёх) оставляют в качестве контроля; в них вносят по 0,1 мл свежей питательной среды без сыворотки. В другие 4-6 пробирок с клеточным монослоем вносят по 0,1 мл вируссодержащего материала. Все культуры в пробирках (контрольные и опытные) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37С 20-30 минут. Затем в них добавляют по 0,9 мл питательной среды без сыворотки, ставят в термостат и ежедневно наблюдают за ними, сравнивая под микроскопом опытные культуры клеток с контрольными.

Необходимо иметь в виду, что при внесении вируса и при последующем его выращивании пробирки выдерживают в термостате под углом так, чтобы клеточный слой был покрыт питательной средой. Поэтому на пробирках принято делать продольные прямые линии цветным карандашом. Пробирки укладывают всегда линией вверх.

Учёт результатов заражения. В контрольных культурах клеток обычно в течение недели морфологических изменения не отмечают. В опытных культурах под воздействием вируса видимые изменения в клетках могут наступить уже через 1012 часов, или через несколько дней, или заметной деструкции клеток не наступит. Всё это зависит от восприимчивости ткани к данному вирусу, свойств и дозы вируса, условий культивирования и т.д. Кроме того, следует учитывать также, что морфологические клетки могут изменяться под воздействием токсических веществ, содержавшихся в исследуемом материале.

Чтобы убедиться в отсутствии действии вируса на клетки или подтвердить специфичность этого действия , а также убедиться в том, что наступившая дегенерация клеток не является результатом действия токсических веществ, из зараженных тканей отсасывают культуральную жидкость и заражают ею свежую культуру ткани, т.е. проводят пассаж. Повторение морфологических изменений в пассажах указывает на наличие и размножение вируса. Если в первом дегенерация клеток наступила, а в пассаже она отсутствует, то предполагают наличие в материале токсических веществ.

Отсутствие каких-либо видимых изменений в клетках в первом заражении и пассажах окончательно не исключает наличие вируса в исследуемом материале, т.к. некоторые вирусы не способны вызывать деструкции клеток.

Полуперевиваемые культуры клеток.

Полуперевиваемые культуры клеток – это культуры диплоидных клеток человека и животных. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами (стабилизации, активного роста, старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов. Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).

Культуры диплоидных клеток получают из тканей человека путем серийных пассажей культур клеток, сохраняющих характерную диплоидную конфигурацию хромосом. Преимущество культур диплоидных клеток состоит в высокой чувствительности к различным вирусам.

ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ

Обнаружение вируса в культуре клеток называется индикацией и осуществляется следующими методами:

·Выявлением специфической дегенерации клеток (ЦПД – цитопатогенное действие вируса);

·Обнаружением внутриклеточных включений;

·Под электронным микроскопом;

·По образованию бляшек;

·По положительной реакции гемагглютинации;

·По положительной реакции гемадсорбции;

·По подавлению метаболизма клеток (реакция цветной пробы).

Цитопатогенное действие вируса.

Простейшим признаком, свидетельствующим о размножении вируса, являются дегенеративные изменения в клетках, то есть проявление цитопатогенного действия вируса. Наступившие видимые морфологические изменения в клетке называют цитопатогенным эффектом.

Цитопатические изменения в инфицированных культурах клеток зависят от биологических свойств и дозы исследуемого вируса. Одни вирусы проявляют ЦПД в течение первой недели после заражения (вирус полиомиелита, Коксаки В), другие – спустя 1-2 недели после заражения (аденовирусы).

Просмотр зараженных вирусом клеток проводят под малым увеличением микроскопа (рис. 1). Характер изменений при инфицировании клеточных культур классифицируется на следующие группы:

·Очаговое мелкозернистое перерождение;

·Мелкозернистое перерождение по всему монослою;

·Очаговое гроздевидное скопление клеток;

·Равномерная зернистость клеток;

·Объединение клеток в гигантские многоядерные клетки и симпласты.

Обнаружение внутриклеточных включений.

При репродукции некоторых вирусов внутри протоплазмы или ядра клетки образуются специфические включения. Для их обнаружения культуры клеток выращивают на специальных стеклянных пластинках, помещенных в стерильные пробирки с 2 мл клеточной суспензии. После образования монослоя клетки заражают вирусом и через определенные сроки в зависимости от свойств исследуемого вируса готовят препараты. Для морфологических исследований культуры клеток окрашивают обычными красителями (рис.2).

Обнаружение вирусов с помощью электронного микроскопа.

В большинстве клеток, зараженных вирусом, под электронным микроскопом различают кристаллоподобные структуры с полигональным неупорядоченным содержимым. Именно в этих местах происходит репродукция вирусов, накопление созревших вирионов (рис.3).

Образование бляшек.

Размножение некоторых вирусов (энтеровирусов, арбовирусов, миксовирусов и др.) в культуре клеток можно выявить методом бляшек.

В основе метода лежит появление в монослое зараженных клеток под агаровым покрытием обесцвеченных участков (бляшек). Бляшки представляют собой деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться в отличие от живых клеток (рис. 4).

Реакция гемагглютинации.

Воснове РГА лежит способность некоторых вирусов агглютинировать эритроциты человека, отдельных видов животных и птиц. Впервые явление гемагглютинации эритроцитов вирусом гриппа было описано в 1941 г. Херстом. При вскрытии зараженных гриппом куриных эмбрионов исследователь установил, что кровь, вытекающая из пораженных сосудов, смешиваясь с вируссодержащей аллантоисной жидкостью, собирается в комочки. По РГА можно выявить не только наличие вируса в исследуемом материале, но и определить его гемагглютинирующий титр. РГА применяется для индикации вирусов гриппа, паргриппа, аденовирусной инфекции, кори, полиомиелита и др.

Вкачестве исследуемого материала при геамагглютинации используют аллантоисную и амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куриного эмбриона, взвеси и экстракты из органов животных, а также культуральную жидкость инфицированных клеток. Перед постановкой реакции испытуемый материал освобождается от крупных частиц ценртифугированием.

Компоненты РГА: вирусосодержащий материал, взвесь эритроцитов человека или животных, физиологический раствор (рис.5).

Техника постановки РГА. РГА можно ставить двумя методами: капельным методом на стекле и в пробирках или лунках пластин.

Для постановки капельной реакции на чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю вируссодержащего материала, тщательно перемешивают пипеткой. При положительной реакции через 1-2 минуты макроскопически обнаруживают появление агглютинации эритроцитов в виде хлопьев.

Постановка РГА в пробирках. В штативе устанавливают 10-12 пробирок, в которых готовят последовательные разведения вируса. Затем во все пробирки вносят по 1 мл 1% взвеси

эритроцитов. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют для инкубации. При наличии гемагглютинирующего вируса в исследуемом материале агглютинированные эритроциты осядут на дно пробирки в виде зонтика с неровными зубчатыми краями. При отрицательной РГА эритроциты оседают на дно в виде точки с ровными гладкими краями.

Реакция гемадсорбции.

Сущность реакции гемадсорбции состоит в том, что на поверхности клеток, инфицированных вирусами, обладающими гемадсорбирующей активностью, адсорбируются эритроциты. Реакция гемадсорбци применяется при диагностики гриппа, парагриппа, клещевого энцефалита, оспы.

Компоненты реакции гемадсорбции: пробирки с культурой клеток, зараженных вирусом, 0,5% взвесь эритроцитов (рис.6).

Техника постановки реакции гемадсорбции. Для постановки реакции используют 10

пробирок с хорошо сформированным монослоем клеток. Культуры клеток заражают вирусосодержащим материалом. После 3-7 дневной инкубации добавляют в каждую пробирку 0,2 мл 0,5% стерильной суспензии эритроцитов, выдерживают в течение нескольких минут, затем встряхивают и просматривают под микроскопом. Зараженные вирусом клетки адсорбируют на своей поверхности эритроциты, не зараженные клетки эритроцитов не адсорбируют.

Цветная проба (колориметрический тест).

Заражение клеточных культур цитопатогенным вирусом ведет к подавлению их метаболизма. Последнее можно определить колориметрическим методом (цветной пробой). Свежая питательная среда pH 7,4-7,8, содержащая феноловый красный, имеет красный цвет. Растущие клетки в процессе метаболизма продуцируют кислоту, что приводит к изменению цвета питательной среды на желтый. При заражении вирусом клетки погибают раньше, чем вырабатывают достаточное количество кислоты, чтобы изменить цвет среды на желтый. Таким образом красный цвет среды указывает на размножение вируса, желтый – на отсутствие вируса.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ.

Методы определения типа вирусов (в вируссодержащем материале) относятся к методам идентификации и основаны на нейтрализации вирусов типоспецифическими сыворотками:

·Нейтрализация ЦПД;

·Нейтрализация гемадсорбции;

·Нейтрализация цветной пробы;

·Реакция торможения гемагглютинации;

·Нейтрализация в опыте на животных;

·РСК, ИФА, ПЦР, иммуноблотинг.

Реакции нейтрализации.

Реакции нейтрализации основаны на способности специфических гипериммунных сывороток нейтрализовать инфекционное действие гомологичного вируса в культуре клеток, курином эмбрионе, лабораторных животных. Выбор восприимчивой системы определяется свойствами испытуемого вируса. В реакции нейтрализации один из компонентов (вирус или сыворотка) должны быть обязательно известным и применяться в постоянной дозе. Второй (исследуемый) компонент применяется в различных разведениях (титруется).

Постановка реакции нейтрализации в зависимости от цели осуществляется двумя вариантами. Применяют реакцию нейтрализации для выявления и определения титра специфических антител в сыворотках крови переболевших животных. В этом случае реакция нейтрализации ставится с постоянной дозой известного вируса и разными разведениями испытуемых сывороток.

В сыворотках крови вируснейтрализующие антитела накапливаются, как правило, в период реконвалесценции и могут сохраняться в течение многих месяцев и даже лет. Динамика накопления и исчезновения вируснейтрализующих антител определяется в значительной степени биологией вируса. Так, при гриппе человека вируснейтрализующие антитела в высоких титрах определяются на 2128-й день и содержание их уменьшается к 6 мес. При энцефалите антитела обнаруживаются через 1,5-2 месяца и сохраняются в течение длительного срока.

Компоненты реакций нейтрализации: 1) вирус известного вида (типа) для серологической диагностики заболевания или исследуемый вирус для идентификации; 2) сыворотка, специфическая для идентификации выделенного вируса, или исследуемая сыворотка для серологической диагностики заболевания.

Реакция торможения (задержки) гемагглютинации.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на свойстве специфических антисывороток подавлять (тормозить) гемагглютинирующую способность вирусов. Реакция используется для идентификации неизвестного вируса (по известной специфической сыворотке) или для определения специфических антител в сыворотке переболевших животных (по известному вирусному антигену).

Компоненты РТГА: вирус, специфическая гипериммунная сыворотка, 1% взвесь эритроцитов, физиологический раствор.

При использовании РТГА для серологической диагностики вирусных инфекций парные сыворотки больных титруют с несколькими вирусными антигенами. Специфичность последних, равно как и рабочий титр, заранее проверяются посредством эталонных специфических сывороток.

Положительным результатом РТГА считается отсутствие гемагглютинации в пробирке с большой концентрацией сыворотки.

При использовании РТГА для идентификации выделенного вируса испытуемый вирус относится к тому виду (типу), сыворотка которого вызвала его нейтрализацию и торможение реакции гемагглютинации.

Идентификация вирусов при помощи флюоресцирующих антител.

В основу метода иммунофлюоресцирующих антител положено свойство антител при окрашивании флюорохромами флюоресцировать (светиться) в ультрафеолетовых лучах. Коньюгированные флюорохромами иммунные сыворотки называются «мечеными» При взаимодействии с гомологичным антигеном в клетках ткани или мазках меченые антитела

фиксируются, образуя прочный комплекс антиген-антитело. В люминесцентном микроскопе фиксированные антитела излучают свечение, цвет которого зависит от флюорохрома, использованного для коньюгации. В том случае, если меченый глобулин не гомологичен исследуемому антигену, комплекс антигенантитело не образуется и флюоресцирующий гаммаглобулин легко удаляется при следующей промывке. Методы РИФ просты, высокочувствительны, специфичны, позволяют в течение короткого времени диагностировать заболевание.

Для приготовления препаратов необходимы: исследуемый материал (мазкиотпечатки из органов и тканей больных животных, органы и ткани здоровых животных, культуры клеток, инфицированные вирусом и незараженные культуры клеток), коньюгированный гомологичный

гамма-глобулин или коньюгированные специфические сыворотки, отрицательная коньюгированная сыворотка.

Техника постановки. На предметное стекло делают мазки-отпечатки из патологического материала, предназначенного для исследования. Препарат фиксируют ацетоном в течение 10 минут с последующим высушиванием в течение 20 минут при 37С. На исследуемые препараты наслаивают флюоресцирующий специфический глобулин. Препараты помещают во влажную камеру и окрашивают при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем дважды тщательно промывают фосфатным буферным раствором, высушивают. На препараты наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, просматривают под иммерсионной системой люминесцентного микроскопа в отраженном свете. В положительных случаях специфические антитела, фиксирующиеся в местах расположения вирусного антигена, обнаруживают по свечению.

Риккетсии – мелкие (0,35-1.0 мкм) грамотрицательные, полиморфные бактерии, являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами. Риккетсии разнообразны по форме и выделяют следующие типы:

1.кокковидные однозернистые (до 0,5 мкм);

2.палочковидные двухзернистые (1-1,5 мкм);

3.бациллярные трех-четырехзернистые (3-4 мкм);

4.нитевидные многозернистые (10-40 мкм).

Зерна (нуклеопротеиды) обнаруживаются при окраске по Романовскому-Гимзе. Все формы взаимообратимы. Структурно имеют все компоненты бактериальной клетки: клеточную стенку, липоидную капсулу, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, пили. Риккетсии содержат как ДНК, так и РНК, обладают высоким содержанием фосфолипидов, содержание углеводов невелико. В большинстве случаев (кроме вида Rochalimaea guintana) на искусственных питательных средах риккетсии не растут. Жизненный цикл риккетсий зависит от жизнедеятельности клетки-хозяина и складывается из двух стадий: вегетативной и покоящейся (элементарные тельца). Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии (рис. 23) активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью, повидимому, обусловленной жгутиковыми структурами. Риккетсии покоящейся стадии (элементарные тельца) имеют сферическую форму и они не активны. Риккетсии способны к биосинтезу белка, но не могут самостоятельно получать макроэргические соединения, поэтому их можно назвать «энергетическими паразитами» клетокэукариотов. В связи с этим, для культивирования риккетсий обычно заражают куриные эмбрионы

вжелточный мешок (метод Кокса), культуры клеток, в которых некоторые виды риккетсий образуют, как и вирусы, тельца включений. Реже заражают чувствительных лабораторных животных: морских свинок, белых мышей. Порядок Rickettsiales включает виды патогенные для теплокровных животных и человека, переносчиками служат вши, блохи, клещи. Заболевания называются риккетсиозами. Большинство болезнетворных для человека видов риккетсий входит

всостав семейства Rickettsiaceae, роды Rickettsia, Rochalimaea, Coxiella, вызывая эпидемический сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), Кулихорадку (Coxiella burnetti), волынскую лихорадку

(Rochalimaea guintana), лихорадку цуцугамуши (Rickettsia tsutsugamushi) и другие.

Паразитирующие виды ассоциированы с ретикулоэндотелиальными клетками и клетками эндотелия сосудов или эритроцитами.

Методы исследования. Риккетсии хорошо окрашиваются по РомановскомуГимзе в сиреневый цвет, по Морозову (методом серебрения) в черный цвет. NB! Для дифференциации риккетсий применяется метод окраски, предложенный П.Ф. Здродовским: