На первом этапе исследуемый материал высевают в жидкую питательную среду (для накопления возбудителя и определения характера его роста) и на плотную питательную среду (для выделения чистой культуры возбудителя).

Техника посева зависит от характера исследуемого материала и консистенции питательной среды.

Жидкий материал для посева берут бактериологической петлей или стерильной пипеткой. Все манипуляции проводят вблизи пламени горелки.

Бактериологическую петлю перед взятием материала и по окончании посева стерилизуют прокаливанием в пламени горелки. Пипетки после посева погружают в дезраствор.

При посеве в жидкую питательную среду петлю с материалом погружают в среду и легким покачиванием смывают материал. Пипетку погружают в среду и материал сливают.

При посеве на скошенный питательный агар в пробирке петлю с материалом вносят вблизи пламени горелки в пробирку и материал штрихом распределяют по поверхности агара.

Посев материала на агар в чашке Петри проводят с помощью бактериологической петли, шпателя или тампона. Посев бактериологической петлей проводят штрихом по поверхности агара. С помощью шпателя или тампона исследуемый материал распределяется по поверхности среды круговыми движениями.

Для посева в толщу питательной среды материал вносят в стерильную чашку Петри или в пробирку, добавляют остуженный (40-45ОС) расплавленный агар и перемешивают.

Посев уколом в столбик питательной среды проводят с помощью бактериологической иглы или петли путем прокалывания столбика среды.

Student TJ

ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ:

1.Понятие о колонии, штамме, виде.

2.Понятие о питательных средах.

3.Теоретическое основы культивирования.

4.Общие принципы культивирования.

5.Оборудование в процессах культивирования.

6.Принципы и методы выделения чистых культур бактерий.

7.Бактериологическое исследование:

a.Техника посевов микроорганизмов.

b.Посев шпателем и тампоном в чашки Петри.

c.При посеве уколом в столбик питательной среды.

d.Посев материала в толщу питательной среды.

8.Методы выделения чистых культур, основанные на механическом принципе:

a.Метод последовательных разведений.

b.Методы Коха (метод пластинчатых разведений).

c.Метод Дригальского.

d.Метод штриховых посевов.

9.Методы выделения чистых культуроснованные на биологическом принципе: a. По типу дыхания.

b.По спорообразованию.

c.Стойкость микробов к действию кислот и щелочей.

d.Подвижность бактерий.

e.Чувствительность микробов к действию химических веществ, антибиотиков и других противомикробных средств.

f.Введение некоторых.

g.Способность микроорганизмов проникать через неповреждённые кожные покровы.

h.Чувствительность лабораторных животных к возбудителям инфекционных заболеваний.

10.Этапы выделения чистых аэробных культур микроорганизмов:

a.Этап исследования.

11.Идентификация микроорганизмов с помощью бактериофагов:

a.Фаготипирование микроорганизмов.

b.Фаготипирование бактерий.

12.Определение бактериоциногенности микроорганизмов.

13.Молекулярно-генетические методы.

14.Основные виды идентификации чистых культур:

a.Морфологическая идентификация.

b.Культуральная идентификация.

c.Биохимическая идентификация.

d.Серологическая идентификация.

e.Биологическая идентификация.

Самостоятельная работа студентов:

1.Изучение культуральных свойств выделенной культуры.

2.Рост различных видов бактерий на жидких питательных средах. 3.Рост различных видов бактерий на плотных питательных средах. 4.Изучение колоний и выделение чистой культуры.

5.Биохимическая идентификация и изучение ферментативной активности на среде Гисса и МПБ. 6.Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с использованием стандартных бумажных дисков.

Понятие о колонии, штамме, виде.

Колонии микроорганизмов-видимые невооруженным глазом скопления клеток (бактерии, дрожжевые грибы) или разрастания мицелия (плесневые грибы) одного вида микроорганизмов; образуются при их размножении или росте на твердом субстрате; имеют вид плоских или выпуклых образований на поверхности плотной питательной среды. К. м. получают в лабораторных условиях посеве микроорганизмов на мясопептонный агар или другие среды. К. м. бывают крупные или мелкие, гладкие или складчатые, блестящие или матовые, с краями ровными, лопастными или др., сероватые или, при образовании пигментов, окрашенные в различные оттенки желтого, оранжевого, красного или др. цветов; колонии плесневых грибов покрыты пушистым налетом. Характеристика колонии по форме, цвету и др. обычно входит в описание вида микроорганизма. В естественных условиях К. м. могут возникать на поверхности пищевых продуктов, в почве, грунте водоёмов.

Штамм (от нем. Stamm — буквально «ствол; род») — чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и в определённом месте.

Вид – совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение и генотип, сходных по морфологическим и биологическим свойствам.

Популяция микробов, являющаяся потомством одной родительской клетки, полученная методом микроманипуляций. называется клоном.

Понятие о питательных средах.

Питательная среда — однокомпонентный или многокомпонентный субстрат, применяемый для культивирования или культур клеток высших организмов. В состав питательных сред должны входить все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов вещества.

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре¬ды, зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.).В лаборатории микроорганизмы выращивают на плотных и жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрасы и чашки Петри. Посуду и питательные среды предварительно стерилизуют.

Посев микроорганизмов требует соблюдения определенных пра¬вил, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую куль-туру от загрязнения посторонними микроорганизмами. Перед посевомследует тщательно надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева.

Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей или иглой, если микроорганизмы выращены на плотной среде. В том случае, когда микроорганизмы выращены в жидкой питательной среде, лучше пользоваться не петлей, а стерильной пипеткой

После пересева пробирку или другие сосуды, в которых выращивают микроорганизмы, помещают в термостаты, где с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная температура Посуду с культурами микроорганизмов, подлежащими выбрасыванию, следует автоклавировать, чтобы убить клетки, и только после этого мыть. Культуры на плотных питательных средах можно заливать на сутки дезинфицирующим раствором, после чего их выбрасывают и посуду моют.

Техника посева микроорганизмов на питательные среды.

Посев уколом осуществляется уколом микробиологической петлёй или иглой в столбик плотной или полужидкой питательной среды. Применяется для выращивания анаэробов, для выявления характера роста по ходу укола и для определения газообразования. У подвижных и неподвижных микроорганизмов характер роста будет различным. Посев уколом практикуют также для длительного хранения культур. Посев

петлей (посев штрихами) по методу Гольда. На внешней стороне дна чашки Петри с питательным агаром проводят разграничительные линии, разделяющие её на 4 сектора. Исследуемый материал вносят петлёй в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлёй, не изменяя её положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток микроорганизмы вырастают в виде отдельных колоний.

Посев шпателем по методу Дригальского. Используют 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлёй или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель, не обеззараживая, переносят во 2-ю чашку и втирают оставшиеся на нём микроорганизмы в поверхность питательной среды.

Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев.

На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на третьей или на второй и третьей чашках вырастают отдельные колонии, пригодные

для выделения чистой культуры.

Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду свежескошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая материал из верхнего края роста культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно выделить чистую культуру.

Принципы и методы выделения чистых культур бактерий.

Для выделения чистой культуры микроорганизмов, изучения их биологических свойств с целью идентификации, а также для получения биомассы необходимо размножить микроорганизмы в условиях лаборатории.

Культивирование, или выращивание, микробов возможно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Большинство бактерий, дрожжей, плесеней культивируют на искусственных питательных средах. Вирусы и риккетсии размножаются только в живых клетках, культуре тканей, курином эмбрионе или в организме животного. Искусственные среды, применяемые для культивирования микроорганизмов, должны соответствовать определенным требованиям: быть легкоусвояемыми, с необходимым составом 'азотистых и углеводных веществ, витаминов, необходимой концентрацией солей, с определенным водородным показателем (рН среды); обладать буферными свойствами; иметь оптимальный окислительновосстановительный потенциал.

Питательные среды должны также содержать достаточное количество воды и обязательно быть стерильными, т. е. до посева не содержать микроорганизмов. Источником азота в средах могут быть различные органические, редко - неорганические соединения. Часто к безбелковым средам добавляют пептон, представляющий собой продукт неполного гидролиза белка. Протеолитические микроорганизмы в качестве азотистого вещества могут использовать желатин («животный студень»). Источником углерода в питательных средах чаще служат углеводы, спирты, некоторые органические кислоты.

Для приготовления искусственных питательных сред можно использовать различные естественные продукты: молоко, кровь, сыворотку, мясо, желток куриного яйца, картофель и другие органические вещества и минеральные соли.

Искусственные питательные среды по назначению подразделяют на четыре основные группы: универсальные, специальные, избирательные (элективные) и дифференциальнодиагностические.

Куниверсальным средам относят мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, на которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. Специальные среды применяют для выращивания бактерий, не множающихся на

универсальных средах. К специальным относят еды с молоком, сывороткой крови, с добавлением крови животных, глюкозы и др. На них выращивают молочнокислые бактерии, патогенные и другие микроорганизмы.

В избирательных (элективных) средах хорошо развиваются только бактерии определенных видов.

Ктаким средам относятся среды обогащения, в которых интересующий исследователя вид растет быстрее сопутствующих бактерий. Например, среда Кесслер, содержащая в своем составе генцианвиолет и желчь крупного рогатого скота, селективна для устойчивых к этим веществам грамотрицательных кишечных палочек и вместе с тем элективна для чувствительных грамположительных бактерий.

Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся:

-среды для определения протеолитической активности (мясопептонный желатин

-МПЖ, молочный агар и др.);

-среды для определения ферментации углеводов (среды Гисса, Эидо, Плоскирева и др.)

-среды для определения гемолитической способности (кровяной агар и другие среды с добавлением крови животных);

-среды для определения восстановительной (редуцирующей) способности микроорганизмов

(среда Вильсон-Блера); -селективные среды, применяемые для дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, полужидкими и жидкими. Для получения сред плотной консистенции к жидким средам добавляют 2-2,5 % агара или 10-20 % желатина. Полужидкие среды получают при добавлении 0,5- 1,0 % агара. Агар (по-малайски «желе») - плотное волокнистое вещество, получаемое из красных водорослей и образующее в водных растворах плотный гель (студень). Он состоит в основном из полисахаридов (70-75 %). Основными компонентами агара являются высокомолекулярные вещества агароза и агаропептин, которые не расщепляются и не усваиваются микроорганизмами. В связи с этим агар не является питательным субстратом, его добавляют в среды исключительно для получения плотной консистенции. Агар расплавляется в воде при 100 °С, а застывает при 40-43 °С. Его выпускают в виде желтоватых пластинок или серовато-белого порошка.

В настоящее время многие питательные среды выпускают в виде готовых сухих средполуфабрикатов, содержащих все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов ингредиенты. Для приготовления питательной среды порошок разводят водой, полученную смесь кипятят, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют.

Большое значение для роста и размножения микроорганизмов на искусственных питательных средах имеют температурные условия. По отношению к температурному режиму все микроорганизмы делят на три группы:

психрофильные (холодолюбивые), мезофильные (средние), термофильные (теплолюбивые). Температурные границы размножения у психрофилов составляют от 0 до 20 °С, у мезофилов - от 20 до 45 °С, у термофилов - от 45 до 70 °С.

При выращивании аэробов посевы культивируют в термостатах при доступе кислорода воздуха, т. е. в обычных условиях. Для культивирования анаэробов создают бескислородные условия, которые можно достичь физическими, химическими и биологическими методами. Используют также анаэробные термостаты.

Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах анаэростатах или в вакуум-эксикаторах, в которые сначала помещают посевы, а затем в аппаратах создают разрежение.

Иногда воздух в анаэростатах заменяют углекислым газом, азотом или другим инертным газом. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика питательного агара или внутри запаянных стеклянных трубок. Анаэробные условия можно создать и более простыми способами: с помощью слоя агара, залитого поверх посевов на плотной питательной среде, или с помощью вазелинового масла, которым покрывают жидкую питательную среду (среда Китта-Тароцци). Химические методы заключаются в том, что в эксикатор с посевами помещают химические вещества например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в герметически закупоренных чашках Петри. При этом кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, после чего начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего питательного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую

чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии. Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непрозрачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культуральные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных питательных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные колонии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кружевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми краями, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Практическое применение фагов.

Бактериофаги широко используют в микробиологических лабораториях (в лабораторной диагностике инфекций), а также в клинике для лечения и профилактики инфекционных заболеваний.

P.O.U. 59g t.me/tgmu12 - 35 -

1.Фагоиндикация – метод определения видовой принадлежности микроорганизмов, выделенных в чистой культуре, по типу лизирующего фага. По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при эпидемиологическом анализе вспышек инфекционных болезней.

2.Фаготипирование – используется при внутривидовой идентификации бактерий, т.е. определении фаговара (фаготипа). Метод основан на строгой специфичности действия фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис (образование стерильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

3.Фаготерапия – применение бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний. Чаще всего используются брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный,

пиобактериофаги и др).

Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

4.Фагопрофилактика - применение бактериофагов с целью профилактики инфекционных заболеваний у людей, бывших в контакте с больным, но статус которых еще не известен (характерные симптомы еще не проявляются).

5.Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК

Методы получения чистых культур:

1.Из колонии (изолированное скопление микроорганизмов одного вида, выросших на питательной среде в результате размножения одной или нескольких клеток) – механическое разобщение бактериальных клеток

• посев петлёй, штрихом по Коху; посев шпателем, газоном по Дригалю; посев осаждением по Коху; посев разбрызгиванием; посев перемешиванием в расплавленном и остуженном студне

2.Путём подавления роста «лишних» микробов

• на избирательных средах; после прогревания; после обработки кислотой; после антибиотиков; использование фагов; после проведения через живой организм Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно стических исследований —

идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов. Культуральные свойства характеризуются питатель ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент обра зуют Serratiamarcescens, золотистый пигмент — Staphylococcusaureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseudomonasaeruginosa.